本文關(guān)鍵詞：bFGF通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對心肌缺血再灌注保護作用的機制研究

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【摘要】：研究背景 缺血性心臟病，繼發(fā)于急性心肌梗死，是世界上最普遍的健康問題之一，同樣也是目前發(fā)病率高和死亡率高的常見的難治性疾病。心臟短暫缺血后，長期再灌注將伴隨著二次損傷，包括氧化應激、炎癥、壞死和凋亡，其中心肌細胞的損失是干擾二次損傷修復的主要因素。已經(jīng)有相關(guān)的研究表明，再灌注同時給予堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）治療對心肌缺血再灌注損傷有緩解和保護作用。作為一種多功能營養(yǎng)因子，bFGF在急性心肌缺血再灌注損傷模型中抑制氧化應激誘導的細胞凋亡這一作用機制未為人知。在以前的研究中，我們已經(jīng)證實再灌注后立即給予bFGF能保護心臟免受缺血再灌注引起的損傷，且可明顯降低心肌梗死區(qū)域面積。然而，在再灌注后心肌損傷的早期階段，bFGF保護作用的分子機制尚不清楚。因此，本次研究旨在闡述bFGF治療在心肌缺血再灌注損傷恢復中的分子機制。 研究方法 體內(nèi)試驗中，對成年雄性C57/B6小鼠（8周-12周齡）左外側(cè)開胸心包，左前降支結(jié)扎30min，用8-0尼龍線和聚乙烯管防止動脈損傷，，然后松開活結(jié)，再灌注4h，即為小鼠急性心肌缺血再灌注模型。將存活的小鼠隨機分成三組：假手術(shù)組、心肌I/R模型組和bFGF治療組。通過心臟超聲心動圖來觀察小鼠心臟功能恢復情況，TUNEL染色檢測凋亡細胞數(shù)，對心肌缺血區(qū)域組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白（GRP78、CHOP和ATF-6）含量的變化進行免疫印跡和免疫熒光檢測。 體外試驗中，用適當濃度的叔丁基過氧化氫（TBHP）處理H9C2細胞造成體外氧化應激損傷模型，通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，觀察bFGF對H9C2細胞的保護作用。為了進一步闡明bFGF的保護作用機制，結(jié)合文獻報道，引入PI3K/Akt特異抑制劑（LY294002）、ERK1/2通路抑制劑（PD98059），Westernblot檢測心肌細胞氧化應激后p-AKT和p-ERK以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白的表達。 研究結(jié)果 1.在小鼠心臟左前降支結(jié)扎缺血30分鐘后，給予bFGF治療，正常飼養(yǎng)三天后，采用二維超聲心動圖對小鼠心臟收縮功能進行檢測，I/R組的左室舒張末內(nèi)徑和左室收縮末內(nèi)徑明顯高于正常組，而給予bFGF治療后，二者數(shù)值明顯緩解，左室射血分數(shù)以及左室短軸縮短率顯著減小，但無法恢復至正常。 2.心肌組織TUNEL熒光染色中，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注損傷4小時后凋亡的陽性細胞數(shù)顯著增加，給予bFGF治療后，凋亡細胞數(shù)明顯減少。此外，bFGF治療組中cleaved-caspase-3以及cleaved-caspase-12的蛋白表達量比I/R損傷組低。 3. bFGF的治療抑制了I/R組小鼠缺血心臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白的活化，與正常組相比，bFGF治療組顯著增加了I/R組小鼠心臟內(nèi)的p-Akt和p-ERK1/2蛋白表達。 4.體外實驗中，TBHP誘導的細胞凋亡在bFGF的治療后下降。bFGF激活了H9C2細胞內(nèi)的PI3K/AKT和ERK1/2通路，抑制了H9C2細胞TBHP誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達。 研究結(jié)論 1. bFGF可以改善心肌缺血再灌注的心功能損傷。 2. bFGF減少心肌缺血再灌注的心肌細胞凋亡。 3. bFGF通過激活PI3K/Akt和ERK1/2信號通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來發(fā)揮保護心肌缺血再灌注損傷的作用。 4.體外試驗中同樣證實bFGF對心肌細胞的保護作用。bFGF通過阻斷PI3K/Akt和ERK1/2信號通路來抑制TBHP誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白的表達。
【關(guān)鍵詞】：堿性成纖維生長因子（bFGF） 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 心肌缺血再灌注
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文縮略詞表9-12
• 第1章 緒論12-19
• 1.1 心肌缺血再灌注與堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）12-13
• 1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應激與心肌缺血再灌注13-14
• 1.3 未折疊蛋白反應14-15
• 1.4 三種未折疊蛋白反應的轉(zhuǎn)錄因子15-17
• 1.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與 UPR 反應17-18
• 1.6 實驗設(shè)計思路18-19
• 第2章 材料及方法19-30
• 2.1 儀器和試劑19-23
• 2.1.1 主要儀器19
• 2.1.2 主要試劑19-20
• 2.1.3 主要抗體20
• 2.1.4 主要試劑的配置20-23
• 2.2 方法23-30
• 2.2.1 小鼠心肌 I/R 模型和分組23
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)23
• 2.2.3 H9C2 細胞加藥處理23-24
• 2.2.4 MTT 法細胞測活24
• 2.2.5 細胞蛋白提取24
• 2.2.6 超聲心動圖24-25
• 2.2.7 TUNEL 熒光染色25
• 2.2.8 FACSCalibur 流式細胞儀檢測25-26
• 2.2.9 免疫熒光染色26-27
• 2.2.10 免疫印跡27-29
• 2.2.11 統(tǒng)計分析29-30
• 第3章 結(jié)果30-43
• 3.1 bFGF 可以緩解心肌缺血再灌注的心功能損傷30
• 3.2 bFGF 減少心肌缺血再灌注的心肌細胞凋亡30-31
• 3.3 bFGF 緩解小鼠心肌缺血再灌注的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激損傷31-34
• 3.4 bFGF 對小鼠心肌缺血再灌注后 PI3K/Akt 及 ERK1/2 的上調(diào)作用34-35
• 3.5 bFGF 抑制 TBHP 導致的 H9C2 細胞氧化損傷的凋亡35-37
• 3.6 bFGF 減少 H9C2 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡37-38
• 3.7 bFGF 激活 H9C2 細胞中的 PI3K/Akt 和 ERK1/2 途徑38-39
• 3.8 bFGF 通過 PI3K/AKT、ERK1/2 通路調(diào)控 H9C2 細胞 ERS 蛋白的表達39-41
• 3.9 抑制PI3K/Akt 及ERK1/2通路后bFGF對H9C2細胞的保護作用的影響41-43
• 第4章 討論43-46
• 第5章 結(jié)論46-47
• 參考文獻47-53
• 作者簡介53
• 在讀期間發(fā)表論文53-54
• 致謝54

【共引文獻】

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本文編號：683973