本文關(guān)鍵詞：WDR26在大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧所致線粒體自噬中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：背景心肌缺血預(yù)適應(yīng)是目前所發(fā)現(xiàn)的最為強(qiáng)有力的心肌內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象,其具體分子作用機(jī)制尚不清楚。WDR26是利用c DNA芯片技術(shù)和抑制消減雜交技術(shù)克隆的一個(gè)大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)新基因。本研究利用western blot、免疫熒光技術(shù)檢測WDR26在大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧時(shí)的表達(dá)變化及WDR26過表達(dá)對線粒體自噬的影響,探討WDR26在缺氧所致的心肌細(xì)胞線粒體自噬中發(fā)揮的作用機(jī)制,進(jìn)而為臨床上防治心肌缺血損傷提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的探討WDR26在心肌細(xì)胞缺氧引起的線粒體自噬中的作用和機(jī)制,進(jìn)一步揭示其在心肌細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)中的作用,為心肌缺血的防治提供新的思路和線索。方法1.Western blot檢測細(xì)胞缺氧時(shí)WDR26的表達(dá):常規(guī)培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞,采用N2飽和低糖無血清DMEM培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于厭氧袋中密封,于37℃,5%CO2孵育箱內(nèi)分別培養(yǎng)3 h、6 h和12 h,構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型。將實(shí)驗(yàn)分為對照組和缺氧3 h、6 h、12 h組,采用western blot技術(shù)檢測WDR26在大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺氧時(shí)的表達(dá)。2.觀察WDR26過表達(dá)對H9c2心肌細(xì)胞缺氧時(shí)的影響:培養(yǎng)WDR26過表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞,將WDR26的開放閱讀框架ORF克隆入真核表達(dá)載體pc DNA3.1,采用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞株,促進(jìn)WDR26過表達(dá),并構(gòu)建和轉(zhuǎn)染空載體組(Neo group)。實(shí)驗(yàn)分為Neo對照組、Neo缺氧組、WDR26對照組、WDR26缺氧組,構(gòu)建細(xì)胞6 h缺氧模型,檢測細(xì)胞上清培養(yǎng)液LDH含量,MTT比色法檢測細(xì)胞活性。3.觀察WDR26過表達(dá)對缺氧所致細(xì)胞自噬的影響:實(shí)驗(yàn)分為Neo對照組、Neo缺氧組、WDR26對照組、WDR26缺氧組,構(gòu)建細(xì)胞6 h缺氧模型。采用western blot、免疫熒光技術(shù)檢測LC3、p62的表達(dá)變化。應(yīng)用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測線粒體膜電位變化,按照J(rèn)C-1試劑說明書進(jìn)行操作,熒光顯微鏡下觀察JC-1單體或聚合體形成情況,Image J光密度分析軟件對紅/綠比進(jìn)行分析。4.觀察H9c2心肌細(xì)胞缺氧時(shí)線粒體PINK1-Parkin通路的變化:實(shí)驗(yàn)分Neo對照組、Neo缺氧組、WDR26對照組、WDR26缺氧組,構(gòu)建6 h細(xì)胞缺氧模型,采用western blot技術(shù)檢測線粒體蛋白PINK1、Parkin的表達(dá)變化。5.采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果1.與對照組相比,缺氧組WDR26蛋白表達(dá)升高,且在6h達(dá)到高峰。2.與Neo對照組和WDR26對照組相比,Neo缺氧組和WDR26缺氧組上清培養(yǎng)液中LDH釋放明顯上升,而細(xì)胞活力顯著下降;與Neo缺氧組相比,WDR26缺氧組上清培養(yǎng)液LDH釋放顯著下降,而細(xì)胞活力明顯提升。3.與Neo對照組和WDR26對照組相比,Neo缺氧組和WDR26缺氧組LC3II/LC3I比值顯著增加,而p62表達(dá)明顯減少;WDR26缺氧組與Neo缺氧組相比,LC3II/LC3I比值明顯升高,而p62的表達(dá)明顯降低。與Neo對照組和WDR26對照組相比,Neo缺氧組和WDR26缺氧組LC3標(biāo)記的自噬體數(shù)量明顯增加;WDR26缺氧組與Neo缺氧組相比,LC3標(biāo)記的自噬體數(shù)量明顯增多。4.與Neo對照組和WDR26對照組相比,Neo缺氧組和WDR26缺氧組紅/綠熒光比值顯著下降;WDR26缺氧組與Neo缺氧組相比紅/綠熒光比值明顯降低。與Neo對照組和WDR26對照組相比,Neo缺氧組和WDR26缺氧組Parkin和PINK1表達(dá)量顯著增加;WDR26缺氧組與Neo缺氧組相比Parkin和PINK1表達(dá)量明顯升高。結(jié)論1.H9c2心肌細(xì)胞缺氧可誘導(dǎo)WDR26的表達(dá)。2.WDR26可通過PINK1-Parkin通路促進(jìn)細(xì)胞缺氧所致的線粒體自噬,從而對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：心肌細(xì)胞 缺氧 WDR26 PINK1-Parkin 線粒體自噬
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-11
• 1 材料和方法11-21
• 2 結(jié)果21-27
• 3 討論27-31
• 4 小結(jié)31-32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 綜述：心肌缺血預(yù)適應(yīng)的心臟保護(hù)機(jī)制35-48
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 附錄 中英文縮略詞（Abbreviation）48-49
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況49-50
• 致謝50-51
• 個(gè)人簡歷51

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9 陳t跨，

本文編號：677524