本文關鍵詞：TLR4-MyD88通路在DFMG抗LPC誘導內皮細胞損傷中的作用

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【摘要】：目的:探討一種新型活性化合物,7-二氟甲氧基-5,4’-二甲氧基金雀異黃素(7-difluoromethoxy-5,4’-dimethoxygenistein,DFMG),是否通過抑制TLR4-MyD88信號轉導通路拮抗溶血性磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine,LPC)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-12)氧化應激損傷。方法:體外培養(yǎng)HUVEC-12細胞,TLR4-cDNA質粒和TLR4-shRNA質粒分別轉染細胞24h得到TLR4過表達HUVEC-12細胞和TLR4沉默HUVEC-12細胞。用RT-qPCR和Western blotting鑒定是否分別成功過表達和沉默TLR4。用30μmol/L的LPC處理以上兩種細胞24 h,然后加入3.0μmol/L的DFMG孵育24h。應用ELISA分析DFMG對LPC誘導損傷的HUVEC-12細胞TLR4-MyD88通路途徑中IL-6、TNF-α的影響,采用Western blotting檢測DFMG對于LPC誘導損傷的HUVEC-12細胞TLR4-MyD88通路途徑中TLR4、My D88的影響。結果:①TLR4-cDNA質粒轉染后,相對于空白對照組,熒光定量PCR結果顯示TLR4過表達組細胞的TLR4基因表達增加(P0.01),Western blotting結果顯示TLR4過表達HUVEC-12細胞的TLR4蛋白表達增加。tlr4-shrna質粒轉染后,相對于空白對照組,熒光定量pcr結果顯示tlr4沉默huvec-12細胞的tlr4基因表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。westernblotting結果顯示tlr4沉默huvec-12細胞的tlr4蛋白表達明顯降低。驗證tlr4-cdna質粒和tlr4-shrna質粒分別轉染后獲得tlr4過表達huvec-12細胞和tlr4沉默huvec-12細胞。②elisa結果顯示:lpc損傷組、tlr4過表達組和tlr4過表達+lpc損傷組的il-6、tnf-α分泌量相對空白對照組均明顯上升(p0.05),其中tlr4過表達+lpc損傷組增高最為顯著(p0.05)。tlr4沉默組和tlr4沉默+lpc損傷組的il-6、tnf-α分泌量較lpc損傷組均明顯下降(p0.05)。tlr4過表達+lpc損傷+dfmg組的il-6、tnf-α表達量與tlr4過表達+lpc損傷組比較顯著下降(p0.05)。tlr4沉默+lpc損傷+dfmg組的il-6、tnf-α表達量與tlr4沉默+lpc損傷組和lpc損傷組比較均明顯下降(p0.05)。dfmg組的il-6、tnf-α分泌量同空白對照組相當,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。③westernblotting結果顯示:lpc損傷組、tlr4過表達組和tlr4過表達+lpc損傷組的tlr4、myd88蛋白表達量相對空白對照組有所上升,其中tlr4過表達+lpc損傷組上升最為明顯。tlr4沉默組和tlr4沉默+lpc損傷組所表達的tlr4、myd88蛋白相對于lpc損傷組明顯下降。tlr4過表達+lpc損傷+dfmg組的tlr4、myd88蛋白表達量與tlr4過表達+lpc損傷組比較顯著下調。而tlr4沉默+lpc損傷+dfmg組比tlr4沉默+lpc損傷組和lpc損傷組的TLR4、MyD88蛋白量都明顯減少。DFMG組的TLR4、MyD88蛋白表達量與空白對照組差異不明顯。結論:①TLR4-MyD88信號通路介導LPC誘導的HUVEC-12細胞氧化應激損傷。②通過抑制TLR4-MyD88信號轉導拮抗LPC的誘導HUVEC-12細胞損傷是DFMG保護血管內皮細胞氧化應激損傷作用的機制之一。
【關鍵詞】：DFMG 溶血性磷脂酰膽堿 人臍靜脈內皮細胞 TLR4 MyD88
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-13
• 引言13-15
• 第一章 TLR4基因過表達對DFMG抗LPC誘導內皮細胞損傷和TLR4-MyD88通路的影響15-33
• 1. 實驗材料15-17
• 1.1 細胞、質粒和感受態(tài)細胞15
• 1.2 實驗試劑15-16
• 1.3 實驗儀器16-17
• 1.4 特殊試劑配制17
• 2. 實驗方法17-24
• 2.1 HUVEC-12細胞的培養(yǎng)17-18
• 2.2 TLR4 cDNA質粒的轉染18-19
• 2.3 實時定量PCR分析.19-22
• 2.4 Western blotting22-23
• 2.5 ELISA測定23-24
• 2.6 DFMG對LPC誘導的TLR4過表達HUVEC-12細胞TLR4和MyD88蛋白表達的影響24
• 2.7 統(tǒng)計學分析24
• 3. 結果24-33
• 3.1 TLR4 cDNA轉染對TLR4基因表達的影響24-27
• 3.2 DFMG對LPC誘導TLR4過表達HUVEC-12細胞TNF-α 和IL-6分泌的影響27-31
• 3.3 DFMG對LPC誘導TLR4過表達HUVEC-12細胞TLR4和My D88蛋白表達的影響31-33
• 第二章 TLR4基因沉默對DFMG抗LPC誘導內皮細胞損傷和TLR4-MyD88通路的影響33-43
• 4. 實驗材料33
• 4.1 細胞、質粒和感受態(tài)細胞33
• 4.2 實驗試劑33
• 4.3 實驗儀器33
• 4.4 特殊試劑配制33
• 5. 實驗方法33-35
• 5.1 HUVEC-12細胞的培養(yǎng)33
• 5.2 TLR4 shRNA質粒的轉染33-34
• 5.3 實時定量PCR分析34
• 5.4 Western blotting ..34
• 5.5 ELISA測定34-35
• 5.6 DFMG對LPC誘導的TLR4過表達HUVEC-12細胞TLR4和MyD88蛋白表達的影響35
• 5.7 統(tǒng)計學分析35
• 6. 結果35-43
• 6.1 TLR4 shRNA轉染對TLR4基因表達的影響35-38
• 6.2 DFMG對LPC誘導TLR4沉默HUVEC-12細胞TNF-α 和IL-6分泌的影響38-41
• 6.3 DFMG對LPC誘導TLR4沉默HUVEC-12細胞TLR4和MyD88蛋白表達的影響41-43
• 討論43-46
• 結論46-47
• 參考文獻47-51
• 綜述51-60
• 參考文獻56-60
• 英文縮寫詞表60-61
• 攻讀碩士學位期間的主要成果61-62
• 致謝62-63

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本文編號：660491