本文關(guān)鍵詞：miR-21靶向調(diào)控Jagged-1在心肌纖維化中的作用

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【摘要】：目的:基于Notch信號通路篩選出可能調(diào)控心肌纖維化的miRNA,從中選出調(diào)控作用最顯著的miRNA(本研究篩選出miR-21/miRNA-21)。并進(jìn)一步研究miR-21通過靶向調(diào)控Notch信號通路的配體蛋白Jag1(Jagged-1)在心肌纖維化中的作用。方法:1、分離大鼠心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblast,CFB),原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)至細(xì)胞最佳狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分為三組:未加TGF-β1(Transforming growth factor-β1)組、10ng/ml TGF-β1組、10ng/ml TGF-β1+10μM DAPT組。經(jīng)RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄與q PCR,篩選調(diào)控心肌纖維化新型miRNA(假定為miRNA-X)。2、在TGF-β1刺激前,轉(zhuǎn)染miRNA-X的抑制劑,通過WB(Western Blot)檢測TGF-β1刺激下的Vimentin和α-SMA(α-smooth muscle actin)的表達(dá)情況,明確在TGF-β1刺激下,miRNA-X對心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Cardiac fibroblast-myofibroblast transformation,CMT)的影響作用。3、轉(zhuǎn)染miRNA-X的抑制劑,陰性對照為無義的抑制劑,利用CCK8(cell counting kit)試劑盒檢測miRNA-X對心肌成纖維細(xì)胞增殖能力的影響,進(jìn)一步篩選出調(diào)控心肌纖維化效果最顯著的miRNA。4、構(gòu)建psi CHECK-2-Jag1 3’-UTR WT(Wild-Type)/Muta(Mutation),將pre-miR-21、對照質(zhì)粒分別與psi CHECK-2-Jag1 3’-UTR WT、psi CHECK-2-Jag13’-UTR Muta共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,裂解細(xì)胞,檢測熒光素酶的熒光強(qiáng)度,分析miR-21與Jag1的3’-UTR的相互關(guān)系。5、構(gòu)建腺病毒Ad-GFP(Adenovirus-Green Fluorescent Protein)以及Ad-miR-21-sponge(Adenovirus-miR-21-sponge),分離大鼠心肌成纖維細(xì)胞,原代培養(yǎng),傳代至細(xì)胞生長穩(wěn)定,分為兩組,分別轉(zhuǎn)染Ad-GFP以及Ad-miR-21-sponge,36h后以TGF-β1處理,提取蛋白,WB檢測Vimentin、DDR2、a-SMA、Tensin的表達(dá)情況。利用CCK8試劑盒檢測miR-21對心肌成纖維細(xì)胞增殖能力的影響,Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測心肌成纖維細(xì)胞的遷移能力。WB檢測Jag1蛋白表達(dá)。結(jié)果:TGF-β1刺激CFB細(xì)胞中,miR-21、miR-23b、miR-140表達(dá)量影響比較明顯,其中miR-21可與Jag1的3’-UTR結(jié)合。阻斷miR-21,可顯著抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖能力,并可抑制其遷移能力,逆轉(zhuǎn)TGF-β1刺激下心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。結(jié)論:miR-21通過靶向調(diào)控Notch信號通路的配體蛋白Jag1,抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,發(fā)揮抗心肌纖維化作用。
【關(guān)鍵詞】：Notch信號 miR-21 Jagged-1 心肌纖維化
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文縮略詞表9-10
• 第1章 引言10-13
• 第2章 材料與方法13-28
• 2.1 材料13-15
• 2.1.1 細(xì)胞及菌株13
• 2.1.2 腺病毒載體系統(tǒng)13
• 2.1.3 主要試劑13-14
• 2.1.4 主要儀器14-15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法15-28
• 2.2.1 原代大鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離15-16
• 2.2.2 RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄與q PCR16-17
• 2.2.3 引物設(shè)計(jì)17-18
• 2.2.4 CCK8檢測細(xì)胞活性18
• 2.2.5 病毒載體構(gòu)建18-21
• 2.2.6 Luciferase驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)21-22
• 2.2.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)22
• 2.2.8 Western Blot22-27
• 2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析27-28
• 第3章 結(jié)果28-34
• 3.1 篩選調(diào)控心肌纖維化新型miRNA28
• 3.2 差異miRNA對于CMT的影響28-29
• 3.3 差異miRNA對心肌成纖維細(xì)胞增殖能力的影響29-30
• 3.4 miR-21 靶點(diǎn)Jag1外源性Luciferase驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)30-31
• 3.5 miR-21 對于Jag1表達(dá)量的影響31
• 3.6 miR-21 對于CMT的影響31-32
• 3.7 miR-21 對心肌成纖維細(xì)胞增殖能力的影響32-33
• 3.8 miR-21 對于CFB細(xì)胞遷移能力的影響33-34
• 第4章 討論34-37
• 第5章 結(jié)論與展望37-38
• 5.1 結(jié)論37
• 5.2 展望37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 綜述 miRNA與心肌纖維化的研究進(jìn)展43-48
• 參考文獻(xiàn)46-48

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