本文關(guān)鍵詞：KCa3.1在堿性環(huán)境促進(jìn)高磷誘導(dǎo)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣化的機(jī)制研究

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【摘要】：目的:心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥,也是導(dǎo)致終末期腎病(End stage renal disease,ESRD)患者死亡的首要原因。血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)向成骨樣或成軟骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而導(dǎo)致的動(dòng)脈血管鈣化是發(fā)生心血管事件的關(guān)鍵步驟。ESRD患者在透析過(guò)程中使用碳酸氫鹽透析液,使機(jī)體短暫的處于堿性環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射碳酸氫鈉的大鼠血管鈣化更加嚴(yán)重,但堿性環(huán)境促進(jìn)血管鈣化的機(jī)制并不清楚。中電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道(Intermediateconductance Ca2+-activated K+channels,KCa3.1)是依賴(lài)鈣激活的重要的鉀離子通道,在平滑肌細(xì)胞中廣泛表達(dá),參與多種細(xì)胞調(diào)節(jié)功能,與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān),因此我們推測(cè)其可能在血管鈣化中著重要作用。探究KCa3.1在血管鈣化的作用,為臨床治療提供新靶點(diǎn)。方法:1選擇4周齡健康雄性SD大鼠80g-100g,通過(guò)組織貼壁法進(jìn)行平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng);選擇6周齡健康雄性SD大鼠200g-250g,進(jìn)行體外血管環(huán)培養(yǎng)。SD大鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。2體外血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng):采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,使用10mmol/Lβ-甘油磷酸制備血管平滑肌細(xì)胞鈣化模型。使用10mmol/l HCl和10mmol/l Na HCO3調(diào)整培養(yǎng)基p H值。采用隨機(jī)數(shù)字表法,將血管平滑肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組:正常p H7.4組、高磷p H7.4組、高磷p H7.7組、高磷p H8.0組、正常p H8.0組、TRAM-34干預(yù)組(在高磷p H8.0組培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入20nmol/L TRAM-34)。體外血管環(huán)培養(yǎng):將6周齡SD雄性大鼠麻醉后,無(wú)菌條件下取出胸主動(dòng)脈,小心剝掉外膜、內(nèi)膜后,將血管制成2mm-3 mm長(zhǎng)的血管環(huán),分別置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,調(diào)整p H值方法、血管環(huán)分組及各組培養(yǎng)基情況同體外細(xì)胞培養(yǎng)。3茜素紅染色法和鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法判斷細(xì)胞鈣化程度;von Kossa染色法和鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法判斷血管環(huán)鈣化程度。熒光探針?lè)y(cè)定血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。RT-PCR、Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中KCa3.1和調(diào)節(jié)成骨和軟骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組血管環(huán)中KCa3.1、Runx2表達(dá)。4數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(sx±)表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較用S-N-K檢驗(yàn)(Student-Newman-Keuls,SNK),相關(guān)分析符合雙變量正態(tài)分布作Pearson積差相關(guān)分析。P0.05為差異有顯著性。結(jié)果:1堿性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化和血管環(huán)鈣化的影響1.1堿性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響:細(xì)胞培養(yǎng)12天后,茜素紅染色和鈣含量測(cè)定結(jié)果均顯示:高磷組細(xì)胞鈣鹽沉積明顯高于對(duì)照組(P0.05),且隨著p H升高鈣鹽沉積逐漸增加(P0.05);而TRAM-34干預(yù)組細(xì)胞鈣鹽沉積明顯減少(P0.05)。1.2堿性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)鈣化影響:血管環(huán)培養(yǎng)12天后,硝酸銀染色顯示:高磷組血管中膜棕黑色顆粒沉積較對(duì)照組顯增多,且隨著p H升高棕黑色顆粒沉積明顯增多,TRAM-34能夠明顯減少棕黑色顆粒沉積。鈣含量測(cè)定結(jié)果基本與硝酸銀染色結(jié)果一致。2堿性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣離子濃度影響:細(xì)胞干預(yù)4天后,血管平滑肌細(xì)胞Fluo-3 AM熒光強(qiáng)度和熒光顯色結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,高磷組平滑肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯升高(P0.05),且隨著p H升高熒光強(qiáng)度逐漸升高(P0.05);TRAM-34干預(yù)組平滑肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯降低(P0.05)。3堿性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞KCa3.1、Runx2表達(dá)、ALP活性及大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)KCa3.1、Runx2表達(dá)的影響3.1堿性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的VSMCs KCa3.1、Runx2表達(dá)影響:細(xì)胞培養(yǎng)4天后,RT-PCR及Western Blot結(jié)果均顯示,高磷組平滑肌細(xì)胞KCa3.1、Runx2表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P0.05),且隨著p H升高表達(dá)逐漸升高(P0.05)。TRAM-34可抑制平滑肌細(xì)胞Runx2表達(dá)(P0.05)。ALP活性測(cè)定結(jié)果顯示:細(xì)胞干預(yù)12天后,與正常對(duì)照組相比,高磷組細(xì)胞ALP活性顯著增加(P0.05),且隨著p H升高ALP活性逐漸增加(P0.05);與高磷p H8.0組相比,TRAM-34干預(yù)組細(xì)胞ALP活性顯著減少(P0.05)。3.2堿性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)KCa3.1、Runx2表達(dá)的影響:血管環(huán)培養(yǎng)4天后,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,高磷組血管KCa3.1、Runx2表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P0.05),且隨著p H升高KCa3.1、Runx2表達(dá)逐漸增加(P0.05);與高磷p H8.0組相比,TRAM-34干預(yù)組血管Runx2表達(dá)明顯下降(P0.05)。結(jié)論:堿性環(huán)境促進(jìn)高磷誘導(dǎo)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣化,其可能機(jī)制是通過(guò)增加平滑肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流,上調(diào)KCa3.1表達(dá),促進(jìn)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：KCa3.1 血管平滑肌細(xì)胞 血管環(huán) 鈣化 表型轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R54;R692.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫(xiě)10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-22
• 結(jié)果22-24
• 附圖24-29
• 討論29-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 綜述 KCa3.1 在慢性腎臟病中發(fā)揮作用的研究進(jìn)展34-43
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 致謝43-45
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷45

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 白亞玲;徐金升;張睦清;張勝雷;張俊霞;崔立文;張慧然;;細(xì)胞凋亡在維生素K_2抑制高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化中的作用[J];中國(guó)全科醫(yī)學(xué);2015年03期

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本文編號(hào)：627538