本文關(guān)鍵詞：小鼠骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的構(gòu)建

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【摘要】：目前的研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生、發(fā)展到轉(zhuǎn)歸是一種慢性炎癥反應(yīng)的病理過(guò)程,有大量的免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與其中。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)作為目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC),也是唯一能在體內(nèi)直接激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞,在誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化,刺激初始T淋巴細(xì)胞增殖、介導(dǎo)免疫耐受等方面發(fā)揮著重要作用。然而DCs在體內(nèi)的數(shù)量較少,僅占外周單核細(xì)胞的1%左右,如此稀少的數(shù)量給其免疫功能的研究帶來(lái)了不小的困難。因此,能夠在體外準(zhǔn)確、高效的培養(yǎng)出DCs并對(duì)其鑒定,為其后續(xù)再AS小鼠模型上進(jìn)行免疫功能實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。目的:1通過(guò)提取小鼠骨髓細(xì)胞,采用rmGM-CSF、rmIL-4等細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo),建立一種在體外環(huán)境下培養(yǎng)DCs的體系,為課題后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)。2對(duì)體外環(huán)境下培養(yǎng)出來(lái)的DCs從形態(tài)學(xué)、表面分子的表達(dá)情況及對(duì)同種異基因T細(xì)胞的刺激增殖能力三個(gè)方面進(jìn)行鑒定。方法:1小鼠骨髓源性DCs的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)頸椎脫臼法將雄性C57BL/6小鼠處死,在無(wú)菌條件下取出小鼠雙側(cè)股骨、脛骨,用1ml注射器抽取RPMI1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔,沖洗液經(jīng)400目濾網(wǎng)過(guò)濾,去除組織碎片。加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,用RPMI1640全培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為5x105/ml,加入細(xì)胞因子,分裝于培養(yǎng)瓶,置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后收集懸浮細(xì)胞,離心去除上清液,補(bǔ)充培養(yǎng)液及細(xì)胞因子,以后隔日半量換液,第5天將收集的懸浮細(xì)胞分成兩組,一組在培養(yǎng)液中加入lps(1μg/ml)刺激成熟,培養(yǎng)至第7天收集懸浮細(xì)胞,另一組不做lps刺激處理,培養(yǎng)至第7天收集懸浮細(xì)胞。2小鼠骨髓源性dcs的鑒定2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察dcs的生長(zhǎng)與形態(tài)的變化并攝影記錄2.2流式檢測(cè)dcs表面分子分別收集兩組細(xì)胞離心后去上清,細(xì)胞計(jì)數(shù),按照流式抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗體標(biāo)記及同型對(duì)照標(biāo)記,4℃避光孵育30min,離心洗滌,流式檢測(cè)兩組細(xì)胞表面cd80、cd86、mhc-Ⅱ的表達(dá)情況2.3mtt法檢測(cè)同種異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)頸椎脫臼法處死balb/c小鼠,無(wú)菌條件下取出其脾臟,剪碎研磨,得到細(xì)胞懸液,用淋巴細(xì)胞分離液分離出單核細(xì)胞,尼龍毛柱法獲得同種異體t細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞,調(diào)整密度為2x106/ml。取上述方法獲得的imdcs和mdcs,分別按照dc:t細(xì)胞比例為1:5、1:10、1:20、1:40的反應(yīng)比鋪于96孔板中,在37℃、5%co2條件下共培養(yǎng)72h,共培養(yǎng)結(jié)束前4h,在每孔中加入20μlmtt繼續(xù)培養(yǎng)4h,每孔吸取培養(yǎng)液后加入150μl的dmso,室溫震蕩,酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(a)值,檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm。結(jié)果:1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)48h后,部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)半懸浮狀態(tài),并形成細(xì)胞集落,少量細(xì)胞表面出現(xiàn)毛刺狀突起。培養(yǎng)的第5天鏡下觀察可見(jiàn)大量細(xì)胞集落,細(xì)胞集落表面可見(jiàn)大量長(zhǎng)短不一的突起,細(xì)胞體積進(jìn)一步增大,呈懸浮狀態(tài)。加入lps刺激48h后,可見(jiàn)大量毛刺狀突起的dcs從集落釋放出來(lái),呈游離狀態(tài),而未加lps刺激的dcs仍呈集落聚集生長(zhǎng)。2.流式檢測(cè)dcs表面分子細(xì)胞培養(yǎng)第7天分別收集兩組細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)分析其表面分子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,兩組細(xì)胞均高表達(dá)cd11c分子,純度90%。未加lps刺激組的dcs低表達(dá)cd80、cd86、mhc-Ⅱ分子,細(xì)胞表現(xiàn)為未成熟狀態(tài),而在lps刺激組這些表面分子則呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá),細(xì)胞表現(xiàn)為成熟狀態(tài)。3.MTT法檢測(cè)同種異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)單因素析因方差分析結(jié)果顯示兩組DCs刺激T細(xì)胞增殖的能力隨著DCs所占比例的增大而增強(qiáng),在相同比例條件下,imDCs刺激T細(xì)胞增殖的能力顯著低于mDCs刺激T細(xì)胞增殖的能力,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取小鼠骨髓細(xì)胞,采用rmGM-CSF、rmIL-4等細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo),建立了一種在體外環(huán)境下培養(yǎng)DCs的體系,并從形態(tài)學(xué)、表面分子的表達(dá)情況及對(duì)同種異基因T細(xì)胞的刺激增殖能力三個(gè)方面對(duì)DCs加以鑒定。此方法培養(yǎng)出的DCs細(xì)胞形態(tài)典型,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：小鼠 樹(shù)突狀細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-17
• 資料與方法17-22
• 結(jié)果22-27
• 討論27-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻(xiàn)35-39
• 附錄39-40
• 致謝40-42
• 綜述42-48
• 參考文獻(xiàn)46-48

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2 趙謹(jǐn) ,王心;樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells)[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;2005年06期

3 張臨友,郭松,楊寶峰;激素與樹(shù)突狀細(xì)胞[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(移植與血液凈化分冊(cè));2005年05期

4 吳萍萍;杜曉英;劉書(shū)遜;陳榮軍;壽張飛;陳江華;;不同來(lái)源人樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)誘導(dǎo)及鑒定[J];浙江醫(yī)學(xué);2007年09期

5 ;封面圖片——樹(shù)突狀細(xì)胞[J];中國(guó)廠礦醫(yī)學(xué);2009年04期

6 張錦X,陳海濱,謝慶東,王駿;人血樹(shù)突狀細(xì)胞形成細(xì)胞簇功能的體外觀察[J];解剖學(xué)雜志;1997年02期

7 曹華,張銳,裴雪濤;樹(shù)突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2000年06期

8 王黎明,劉艷榮,李金蘭,常艷,付家瑜,高暉,陳珊珊;人慢性粒細(xì)胞白血病樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2000年05期

9 夏青,張學(xué)軍;真皮樹(shù)突狀細(xì)胞與皮膚病[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊(cè);2000年02期

10 劉青,金巖,吳織芬;樹(shù)突狀細(xì)胞與口腔疾病[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2000年06期

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1 蔣應(yīng)明;萬(wàn)濤;陳國(guó)友;夏大靜;周向陽(yáng);修方明;張意;曹雪濤;;樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源的鈣粘著相關(guān)蛋白新基因的克隆、表達(dá)及功能研究[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

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