本文關(guān)鍵詞：小鼠骨髓源性樹突狀細胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的構(gòu)建

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【摘要】：目前的研究認為動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生、發(fā)展到轉(zhuǎn)歸是一種慢性炎癥反應(yīng)的病理過程,有大量的免疫細胞和炎癥介質(zhì)參與其中。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)作為目前已知的體內(nèi)功能最強大的專職抗原提呈細胞(antigen-presenting cell,APC),也是唯一能在體內(nèi)直接激活初始T細胞的抗原提呈細胞,在誘導(dǎo)T淋巴細胞活化,刺激初始T淋巴細胞增殖、介導(dǎo)免疫耐受等方面發(fā)揮著重要作用。然而DCs在體內(nèi)的數(shù)量較少,僅占外周單核細胞的1%左右,如此稀少的數(shù)量給其免疫功能的研究帶來了不小的困難。因此,能夠在體外準確、高效的培養(yǎng)出DCs并對其鑒定,為其后續(xù)再AS小鼠模型上進行免疫功能實驗奠定了基礎(chǔ)。目的:1通過提取小鼠骨髓細胞,采用rmGM-CSF、rmIL-4等細胞因子聯(lián)合誘導(dǎo),建立一種在體外環(huán)境下培養(yǎng)DCs的體系,為課題后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)。2對體外環(huán)境下培養(yǎng)出來的DCs從形態(tài)學(xué)、表面分子的表達情況及對同種異基因T細胞的刺激增殖能力三個方面進行鑒定。方法:1小鼠骨髓源性DCs的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)頸椎脫臼法將雄性C57BL/6小鼠處死,在無菌條件下取出小鼠雙側(cè)股骨、脛骨,用1ml注射器抽取RPMI1640培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔,沖洗液經(jīng)400目濾網(wǎng)過濾,去除組織碎片。加入紅細胞裂解液裂解紅細胞,用RPMI1640全培養(yǎng)液配成細胞懸液,細胞計數(shù)板計數(shù),調(diào)整細胞濃度為5x105/ml,加入細胞因子,分裝于培養(yǎng)瓶,置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后收集懸浮細胞,離心去除上清液,補充培養(yǎng)液及細胞因子,以后隔日半量換液,第5天將收集的懸浮細胞分成兩組,一組在培養(yǎng)液中加入lps(1μg/ml)刺激成熟,培養(yǎng)至第7天收集懸浮細胞,另一組不做lps刺激處理,培養(yǎng)至第7天收集懸浮細胞。2小鼠骨髓源性dcs的鑒定2.1細胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下動態(tài)觀察dcs的生長與形態(tài)的變化并攝影記錄2.2流式檢測dcs表面分子分別收集兩組細胞離心后去上清,細胞計數(shù),按照流式抗體說明書進行抗體標記及同型對照標記,4℃避光孵育30min,離心洗滌,流式檢測兩組細胞表面cd80、cd86、mhc-Ⅱ的表達情況2.3mtt法檢測同種異基因混合淋巴細胞反應(yīng)(mlr)頸椎脫臼法處死balb/c小鼠,無菌條件下取出其脾臟,剪碎研磨,得到細胞懸液,用淋巴細胞分離液分離出單核細胞,尼龍毛柱法獲得同種異體t細胞作為反應(yīng)細胞,調(diào)整密度為2x106/ml。取上述方法獲得的imdcs和mdcs,分別按照dc:t細胞比例為1:5、1:10、1:20、1:40的反應(yīng)比鋪于96孔板中,在37℃、5%co2條件下共培養(yǎng)72h,共培養(yǎng)結(jié)束前4h,在每孔中加入20μlmtt繼續(xù)培養(yǎng)4h,每孔吸取培養(yǎng)液后加入150μl的dmso,室溫震蕩,酶標儀測定各孔的吸光度(a)值,檢測波長為570nm。結(jié)果:1.細胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)48h后,部分細胞開始出現(xiàn)半懸浮狀態(tài),并形成細胞集落,少量細胞表面出現(xiàn)毛刺狀突起。培養(yǎng)的第5天鏡下觀察可見大量細胞集落,細胞集落表面可見大量長短不一的突起,細胞體積進一步增大,呈懸浮狀態(tài)。加入lps刺激48h后,可見大量毛刺狀突起的dcs從集落釋放出來,呈游離狀態(tài),而未加lps刺激的dcs仍呈集落聚集生長。2.流式檢測dcs表面分子細胞培養(yǎng)第7天分別收集兩組細胞用流式細胞術(shù)分析其表面分子的表達情況。結(jié)果顯示,兩組細胞均高表達cd11c分子,純度90%。未加lps刺激組的dcs低表達cd80、cd86、mhc-Ⅱ分子,細胞表現(xiàn)為未成熟狀態(tài),而在lps刺激組這些表面分子則呈現(xiàn)出明顯的高表達,細胞表現(xiàn)為成熟狀態(tài)。3.MTT法檢測同種異基因混合淋巴細胞反應(yīng)單因素析因方差分析結(jié)果顯示兩組DCs刺激T細胞增殖的能力隨著DCs所占比例的增大而增強,在相同比例條件下,imDCs刺激T細胞增殖的能力顯著低于mDCs刺激T細胞增殖的能力,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:本實驗通過提取小鼠骨髓細胞,采用rmGM-CSF、rmIL-4等細胞因子聯(lián)合誘導(dǎo),建立了一種在體外環(huán)境下培養(yǎng)DCs的體系,并從形態(tài)學(xué)、表面分子的表達情況及對同種異基因T細胞的刺激增殖能力三個方面對DCs加以鑒定。此方法培養(yǎng)出的DCs細胞形態(tài)典型,為后續(xù)的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：小鼠 樹突狀細胞 細胞培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-17
• 資料與方法17-22
• 結(jié)果22-27
• 討論27-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻35-39
• 附錄39-40
• 致謝40-42
• 綜述42-48
• 參考文獻46-48

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本文編號：567671