本文關(guān)鍵詞：雷公藤對(duì)ITP患者T細(xì)胞亞群IDO與TTS表達(dá)的影響

  更多相關(guān)文章： 雷公藤 免疫性血小板減少性紫癜 吲哚胺2 3-雙加氧酶 色氨酰-tRNA合成酶

【摘要】：背景：免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia,ITP)是由于自身反應(yīng)性T和B淋巴細(xì)胞被血小板自身抗體激活,機(jī)體發(fā)生一系列免疫反應(yīng),導(dǎo)致體內(nèi)血小板生成減少,破壞增多的自身免疫性疾病。ITP患者具有皮下粘膜出血、骨髓巨核細(xì)胞增多等臨床特點(diǎn),嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致內(nèi)臟出血。雷公藤(Tripterygium wilfordii,TW)具有免疫抑制效應(yīng),是臨床常用的治療自身免疫性疾病的一味具有抗炎、免疫抑制效應(yīng)的中藥。吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)通過(guò)介導(dǎo)色氨酸沿犬尿氨酸的代謝途徑來(lái)誘導(dǎo)和維持機(jī)體的外周免疫耐受。而色氨酰-tRNA合成酶(Tryptophanyl-tRNAsynthetase,TTS)則是通過(guò)將色氨酸加載到它特異的tRNA上,形成蛋白復(fù)合物拮抗IDO對(duì)色氨酸的消耗參與機(jī)體免疫反應(yīng)。本研究通過(guò)觀察臨床ITP患者使用雷公藤治療的療效,同時(shí)檢測(cè)ITP患者雷公藤治療前后T細(xì)胞中IDO與TTS表達(dá)的情況,了解雷公藤對(duì)ITP患者IDO/TTS介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑的影響。目的：1.觀察ITP患者使用雷公藤的療效；2.檢測(cè)雷公藤使用前后,ITP患者T細(xì)胞中IDO與TTS表達(dá)的變化情況,了解雷公藤對(duì)ITP患者IDO/TTS介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑的影響；3.通過(guò)檢測(cè)雷公藤與地塞米松分別刺激ITP患者PBMCs細(xì)胞后,患者T細(xì)胞IDO與TTS表達(dá)的變化情況,進(jìn)一步驗(yàn)證雷公藤、地塞米松對(duì)ITP患者IDO/TTS介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑的影響。方法：1.研究對(duì)象的納入：臨床收治初診或復(fù)發(fā)的ITP患者25例,排除糖尿病、結(jié)核、肝炎、消化道潰瘍、高血壓等疾病。抽血前至少30天未使用免疫抑制劑治療。納入對(duì)象均采用雷公藤多甙片每日按每千克體重1-1.5mg的劑量進(jìn)行治療。在治療前及治療后第5天抽取患者肝素抗凝全血標(biāo)本。選取健康人25例為正常對(duì)照組,均不做任何治療處理。2.單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：采集患者和健康對(duì)照人群的肝素抗凝血標(biāo)本l0ml,用淋巴細(xì)胞分離液梯度分離單個(gè)核細(xì)胞,吸取中間白膜層細(xì)胞,用PBS洗滌兩次后,調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/ml,用配制好的改良型1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并分別用2nM的雷公藤溶液和luM的地塞米松溶液與單個(gè)核細(xì)胞共同培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)。3.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)PBMCs壞死率：收集培養(yǎng)12小時(shí)后的細(xì)胞,將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105個(gè)/ml。每管加碘化丙啶(Propidium,PI)5ul,室溫避光孵育15min后上機(jī)檢測(cè)。4.檢測(cè)IDO與TTS的表達(dá)：表染CD4、CD8抗體,破膜后胞內(nèi)染IDO與TTS抗體后,上機(jī)檢測(cè)CD4+與CD8+細(xì)胞中IDO與TTS表達(dá)的變化情況。同時(shí)用RT-PCR檢測(cè)IDO、 TTS mRNA的表達(dá)。結(jié)果：1.雷公藤治療ITP患者臨床有效率為80%。2.FCM檢測(cè)雷公藤治療前后ITP患者T細(xì)胞中IDO與TTS的表達(dá)結(jié)果：與正常對(duì)照組相比,ITP患者CD4+與CD8+細(xì)胞中IDO的表達(dá)量降低,而TTS的表達(dá)量則明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。有效組治療后,患者CD4+與CD8+細(xì)胞中IDO的表達(dá)量與治療前相比明顯上升,TTS的表達(dá)量則明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。但在治療無(wú)效組中,患者CD4+與CD8+細(xì)胞中IDO與TTS的表達(dá)量與治療前相比均無(wú)明顯差異(P0.05)。3.RT-PCR檢測(cè)雷公藤治療前后IDO和TTS mRNA的表達(dá)結(jié)果：有效組治療前PBMCs的IDO mRNA的表達(dá)量較正常對(duì)照組低,而TTS mRNA表達(dá)量較正常對(duì)照組高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。雷公藤治療后,PBMCs中IDO的表達(dá)量比治療前增高,TTS的表達(dá)量減低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.PI檢測(cè)PBMCs壞死率：正常對(duì)照組、病人空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、雷公藤處理組、地塞米松處理組中PBMCs壞死率分別為：0.70%、0.46%、0.70%、0.94%、0.79%。所測(cè)孔中PBMCs壞死率均1%。5.FCM檢測(cè)藥物刺激后T細(xì)胞中IDO和TTS的表達(dá)結(jié)果：ITP患者空白對(duì)照CD4+與CD8+細(xì)胞中IDO的表達(dá)量與正常對(duì)照組相比降低,TTS表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。雷公藤處理后的患者CD4+與CD8+細(xì)胞中IDO的表達(dá)量較患者空白對(duì)照中CD4+與CD8+細(xì)胞中IDO的表達(dá)量增高,TTS的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。地塞米松處理后患者CD4+與CD8+細(xì)胞中IDO的表達(dá)量較患者空白對(duì)照增高,TTS的表達(dá)量減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。溶劑對(duì)照組與病人空白對(duì)照組之間、雷公藤處理組與地塞米松處理組之間CD4+與CD8+細(xì)胞中IDO與TTS的表達(dá)量無(wú)明顯變化(P0.05)。6. RT-PCR檢測(cè)藥物作用后PBMCs中IDO和TTS的mRNA表達(dá)結(jié)果：ITP患者空白對(duì)照的PBMCs中IDO mRNA表達(dá)與正常對(duì)照相比減低,TTS表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。雷公藤處理后患者PBMCs中IDO mRNA表達(dá)較患者空白對(duì)照增高,TTS的表達(dá)量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。地塞米松處理后PBMCs中IDO mRNA表達(dá)較患者空白對(duì)照增加,TTS的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。溶劑對(duì)照組與病人空白對(duì)照組之間、雷公藤處理組與地塞米松處理組之間IDO與TTS的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05)。結(jié)論：雷公藤對(duì)提升ITP患者的血小板有明顯療效,與地塞米松相似,也是通過(guò)IDO/TTS介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑發(fā)揮作用。臨床有望使用雷公藤替代糖皮質(zhì)激素對(duì)ITP患者進(jìn)行治療,以避免患者因便用糖皮質(zhì)激素而出現(xiàn)的小良反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：雷公藤 免疫性血小板減少性紫癜 吲哚胺2 3-雙加氧酶 色氨酰-tRNA合成酶
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R558.2
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-11
• 引言11-15
• 第一章 雷公藤多甙片治療ITP患者的臨床療效研究15-18
• 1.1 材料與方法15-16
• 1.1.1 研究對(duì)象15
• 1.1.2 治療方法15
• 1.1.3 療效判定標(biāo)準(zhǔn)15-16
• 1.2 結(jié)果16
• 1.3 討論16-18
• 第二章 雷公藤對(duì)ITP患者IDO、TTS的影響18-30
• 2.1 材料18-20
• 2.1.1 研究對(duì)象18
• 2.1.2 主要試劑和耗材18-19
• 2.1.3 主要儀器19-20
• 2.1.4 主要溶劑的配制20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-23
• 2.2.1 分離患者PBMCs20-21
• 2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群上IDO和TTS的表達(dá)21
• 2.2.3 RT-PCR檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中IDO和TTS mRNA的表達(dá)21-23
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-27
• 2.4.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雷公藤治療前后患者T細(xì)胞上IDO與TTS的表達(dá)結(jié)果23-26
• 2.4.2 RT-PCR檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中IDO和TTS mRNA的表達(dá)結(jié)果26-27
• 2.5 討論27-30
• 第三章 雷公藤、地塞米松刺激對(duì)ITP患者IDO、TTS表達(dá)的影響30-43
• 3.1 材料30-32
• 3.1.1 研究對(duì)象30
• 3.1.2 主要試劑和耗材30-31
• 3.1.3 主要儀器31-32
• 3.1.4 主要溶劑的配制32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-36
• 3.2.1 分離患者PBMCs32-33
• 3.2.2 藥物與PEMCs共培養(yǎng)33
• 3.2.3 單染PI檢測(cè)藥物作用后PBMCs的壞死情況33-34
• 3.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群上IDO和TTS的表達(dá)34
• 3.2.5 RT-PCR檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中IDO和TTS mRNA的表達(dá)34-36
• 3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析36
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-41
• 3.4.1 藥物作用后PBMCs的壞死率36-37
• 3.4.2 藥物作用后T細(xì)胞上IDO與TTS的表達(dá)37-40
• 3.4.3 PCR檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中IDO和TTS基因水平的表達(dá)結(jié)果40-41
• 3.5 討論41-43
• 結(jié)語(yǔ)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 附錄47-55
• 附錄1 ：綜述47-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 附錄253-54
• 附錄354-55
• 在校期間發(fā)表論文情況55-56
• 致謝56

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