本文關(guān)鍵詞：miR-134靶向沉默ANGPTL4對巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)的影響及機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是一種脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)等多種機制相互作用而產(chǎn)生的慢性炎癥性疾病,其中巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)是其發(fā)病的兩個關(guān)鍵因素。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是脂肪酶基因家族中可以水解甘油三脂的核心限速酶,而巨噬細胞中LPL則可以介導(dǎo)巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子表達,從而促進泡沫細胞形成及As的發(fā)生發(fā)展。血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like 4,ANGPTL4)是血管生成素樣蛋白家族的成員之一,越來越多的研究表明ANGPTL4可以抑制LPL活性,過表達巨噬細胞中ANGPTL4可以降低巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和泡沫細胞形成。近年來研究發(fā)現(xiàn)越來越多的micro RNA可以通過多種脂質(zhì)代謝信號途徑參與As的發(fā)生發(fā)展。最新研究顯示miR-134與心肌梗死等心血管疾病密切相關(guān),He等人在動脈硬化患者的血管內(nèi)膜、血漿和巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)miR-134是高表達的,提示miR-134促進As的發(fā)生發(fā)展,但機制尚不明確。通過生物信息學(xué)軟件分析我們發(fā)現(xiàn)miR-134具有靶向結(jié)合ANGPTL4的生物學(xué)基礎(chǔ),本研究目的旨在探討miR-134在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用和機制,為防治As提供新的研究策略和治療靶點。[方法]利用多種生物信息學(xué)Micro RNA相關(guān)網(wǎng)站預(yù)測各物種miR-134序列、保守性、miR-134靶標(biāo)基因、與ANGPTL4結(jié)合位點、靶標(biāo)結(jié)合評分、莖環(huán)結(jié)構(gòu)和自由能評分等。采用雙熒光素酶報告基因法驗證miR-134與ANGPTL4 3’UTR具有靶向結(jié)合作用。THP-1巨噬細胞轉(zhuǎn)染不同濃度(0,10,20,40,80 n M)和不同時間(0、6,12,24,48 h)后,Western blot檢測ANGPTL4蛋白水平,實時定量PCR法檢測ANGPTL4 m RNA水平。利用LPL活性試劑盒檢測miR-134 mimic對巨噬細胞中LPL活性的影響,采用TG試劑盒和HPLC檢測miR-134 mimic對細胞內(nèi)TG及TC、FC和CE的含量的影響,還檢測miR-134對巨噬細胞中介導(dǎo)脂質(zhì)攝取的受體SR-A和CD36表達影響以及LPL和LRP-1結(jié)合情況。觀察miR-134 mimic等對巨噬細胞炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10分泌的影響。[結(jié)果]生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示miR-134在不同物種進化中高度保守,多個靶標(biāo)預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測預(yù)測綜合評分較高,這些結(jié)果顯示miR-134具有靶向結(jié)合ANGPTL4的生物學(xué)作用。細胞轉(zhuǎn)染ANGPTL4野生型和突變型3’UTR后,miR-134組與對照組相比雙熒光素酶活性明顯降低,而突變型3’UTR組雙熒光素酶活性明顯增加,證實miR-134靶向結(jié)合ANGPTL4的生物學(xué)。miR-134還呈劑量和時間依賴性下調(diào)巨噬細胞中ANGPTL4表達,上調(diào)LPL表達和活性,上調(diào)巨噬細胞SR-A和CD36受體的表達和LPL和LRP-1結(jié)合,增加巨噬細胞脂質(zhì)蓄積。miR-134 mimic還可以上調(diào)促炎因子TNF-α、MCP-1、IL-6分泌,下調(diào)抑炎因子IL-10分泌,而miR-134 inhibitor則逆轉(zhuǎn)這些因子的分泌情況。[結(jié)論]miRNA-134靶向沉默ANGPTL4后,上調(diào)巨噬細胞中LPL所介導(dǎo)的脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng),從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：微小RNA-134 血管生成素樣蛋白4 脂質(zhì)蓄積 炎癥反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 第1章 緒論13-19
• 第2章 實驗材料19-25
• 2.1 主要實驗試劑19-21
• 2.2 miRcroRNA公共數(shù)據(jù)庫及在線軟件21-22
• 2.3 主要實驗器材與實驗儀器22-25
• 第3章 實驗方法25-33
• 3.1 生物信息學(xué)預(yù)測25-27
• 3.2 細胞培養(yǎng)27
• 3.3 細胞換液27-28
• 3.4 實時定量PCR（Real-time Quantitative PCR）分析28
• 3.5 酶聯(lián)免疫吸附法28
• 3.6 細胞蛋白抽提與蛋白質(zhì)印跡檢測（Western blotting）28-29
• 3.7 小分子干擾（siRNA）轉(zhuǎn)染29
• 3.8 雙熒光素酶報告基因構(gòu)建與分析29-30
• 3.9 瞬時轉(zhuǎn)染30
• 3.10 LPL活性檢測30-31
• 3.11 高效液相色譜法（HPLC）31
• 3.12 免疫共沉淀分析（Ch IP）31
• 3.13 統(tǒng)計分析31-33
• 第4章 實驗結(jié)果33-49
• 4.1 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果33-36
• 4.2 miR-134 與ANGPTL4靶向結(jié)合作用36-37
• 4.3 miR-134 對巨噬細胞ANGPTL4表達的影響37-39
• 4.4 miR-134 對巨噬細胞LPL表達及活性的影響39-42
• 4.5 miR-134 對巨噬細胞脂質(zhì)蓄積的影響42-44
• 4.6 miR-134 對THP-1 巨噬細胞SR-A和CD36表達的影響44-45
• 4.7 miR-134 對巨噬細胞炎癥因子分泌的影響45-47
• 4.8 miR-134 對LPL與LRP-1 結(jié)合的影響47-49
• 第5章 討論49-53
• 第6章 結(jié)論53-55
• 參考文獻55-59
• 文獻綜述59-71
• 參考文獻67-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文71-73
• 致謝73-75
• 資金資助75

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