本文關(guān)鍵詞：鐵自噬促Sideroflexin1依賴性線粒體鐵超載介導(dǎo)apelin-13誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體,在心血管系統(tǒng)形成及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),apelin-13具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用,且自噬途徑參與了apelin-13誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程。鐵自噬(Ferritinophagy)是最新發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的選擇性自噬。過度激活鐵自噬可能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵超載從而參與心肌肥厚的發(fā)展。本課題擬研究apelin-13對鐵自噬及線粒體鐵代謝的影響,并在前期研究的基礎(chǔ)上探討鐵自噬-線粒體鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sideroflexin1(SFXN1)依賴性線粒體鐵超載介導(dǎo)apelin-13促心肌細(xì)胞肥大的新機(jī)制,揭示apelin-13/APJ系統(tǒng)誘導(dǎo)心肌肥厚的新的作用機(jī)制,為開發(fā)以APJ為靶點(diǎn)的抗心肌肥厚藥物提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1、Western Blot:檢測大鼠H9c2心肌細(xì)胞NCOA4,FTH1,SFXN1,TRC40,Tom7,Tom70,DMT1,BNP,LC3II/I的表達(dá);2、分離線粒體并應(yīng)用WB檢測線粒體蛋白的表達(dá);3、RNA干擾:設(shè)計(jì)RNA干擾鏈分別干擾H9c2心肌細(xì)胞中NCOA4,TRC40,Tom7,SFXN1的表達(dá);4、普魯士藍(lán)染色法(Prussian blue staining)觀察H9c2心肌細(xì)胞及心肌組織中鐵沉積;5、鈣黃綠素(calcein am)熒光探針檢測h9c2心肌細(xì)胞中游離鐵的變化;6、流式細(xì)胞術(shù)檢測h9c2心肌細(xì)胞中線粒體螯合鐵的含量;7、rpa熒光探針觀察h9c2心肌細(xì)胞中線粒體螯合鐵的含量;8、mito-sox熒光探針檢測h9c2細(xì)胞中線粒體ros的生成;9、免疫熒光觀察ncoa4和lc3b共定位;10、sceptertm手持細(xì)胞計(jì)數(shù)器測量h9c2心肌細(xì)胞的直徑和體積;11、bca試劑盒測定h9c2心肌細(xì)胞中的蛋白含量;12、免疫組化觀察人尸檢心肌肥厚心臟組織標(biāo)本和雙腎雙夾大鼠腎血管性高血壓模型大鼠心臟組織中apelin,bnp,ncoa4,sfxn1蛋白的表達(dá);結(jié)果:1、apelin-13增加h9c2心肌細(xì)胞內(nèi)游離鐵含量,且進(jìn)一步促進(jìn)鐵負(fù)載劑-枸櫞酸鐵(fac)誘導(dǎo)的游離鐵的增加;apelin-13誘導(dǎo)h9c2心肌細(xì)胞內(nèi)鐵沉積,且進(jìn)一步促進(jìn)鐵劑fac誘導(dǎo)的鐵沉積;2、apelin-13以劑量(0-1μmol/l)及時間(0-24h)依賴性抑制h9c2細(xì)胞中鐵自噬底物鐵蛋白(fth1)的表達(dá),促進(jìn)鐵自噬貨物受體ncoa4的表達(dá);apj拮抗劑f13a(1μmol/l,24h)阻斷apelin-13(0.1μmol/l,24h)對fth1和ncoa4的作用;apelin-13促進(jìn)ncoa4與gfp-lc3b融合;自噬體降解抑制劑羥基氯喹(hcq)阻斷了apelin-13對fth1的降解作用,進(jìn)一步促進(jìn)了apelin-13對ncoa4的表達(dá);apelin-13進(jìn)一步增強(qiáng)鐵負(fù)載劑-枸櫞酸鐵(fac)誘導(dǎo)的鐵自噬;3、ncoa4-sirna抑制apelin-13(0.1μmol/l,48h)誘導(dǎo)的h9c2心肌細(xì)胞內(nèi)游離鐵的增加;4、apelin-13(0.1μmol/l,48h)促進(jìn)線粒體鐵超載;apelin-13(0.1μmol/l,6h)促進(jìn)線粒體ros增加;透射電子顯微鏡下觀察到apelin-13(0.1μmol/l,12h)引起h9c2心肌細(xì)胞線粒體腫脹及空泡化;5、apelin-13以劑量(0-1μmol/l)和時間(0-24h)依賴性促進(jìn)h9c2心肌細(xì)胞中線粒體轉(zhuǎn)鐵蛋白sfxn1的表達(dá);apj拮抗劑f13a(1μmol/l,24h)阻斷了apelin-13(0.1μmol/l,24h)對sfxn1的作用;6、ncoa4-sirna抑制apelin-13誘導(dǎo)的sfxn1的表達(dá);7、sfxn1-sirna抑制apelin-13誘導(dǎo)的線粒體鐵超載以及線粒體ros的生成;8、apelin-13以劑量(0-1μmol/l)以及時間(0-24h)依賴性促進(jìn)h9c2心肌細(xì)胞中線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶tom7,tom70的表達(dá);apj拮抗劑f13a(1μmol/l,24h)阻斷了apelin-13(0.1μmol/l,24h)對tom7,tom70的誘導(dǎo)作用;apelin-13促進(jìn)tom7錨定于線粒體;9、tom7-sirna抑制apelin-13誘導(dǎo)的sfxn1的表達(dá);10、apelin-13以劑量(0-1μmol/l)和時間(0-24h)依賴性促進(jìn)h9c2細(xì)胞中尾錨蛋白識別因子trc40的表達(dá);apj拮抗劑f13a(1μmol/l,24h)阻斷了apelin-13(0.1μmol/l,24h)對trc40的作用;11、trc40-sirna抑制apelin-13誘導(dǎo)的tom7,sfxn1的表達(dá);12、apelin-13促進(jìn)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)體-二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(dmt1)的表達(dá),且被apj拮抗劑f13a抑制;13、Apelin-13促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大和細(xì)胞內(nèi)蛋白含量增加;apelin-13促進(jìn)心肌肥大因子BNP的表達(dá),且被F13A抑制;14、NCOA4-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大以及心肌肥大因子BNP表達(dá);SFXN1-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大以及心肌肥大因子BNP表達(dá);Tom7-siRNA,TRC40-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)心肌肥大因子BNP的表達(dá);15、人尸檢心肌肥厚心臟標(biāo)本中BNP,apelin,NCOA4,SFXN1高表達(dá);且出現(xiàn)鐵沉積;16、雙腎雙夾腎血管性高血壓模型大鼠心臟組織中BNP,apelin,NCOA4,SFXN1高表達(dá);出現(xiàn)鐵沉積。結(jié)論:鐵自噬促Sideroflexin1(SFXN1)依賴性線粒體鐵超載介導(dǎo)apelin-13誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大
【關(guān)鍵詞】：Apelin-13 APJ 鐵自噬 NCOA4 SFXN1 Tom7 TRC40 線粒體鐵超載 線粒體ROS 心肌細(xì)胞肥大
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 主要英文縮略語索引13-17
• 第1章 緒論17-21
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料21-25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)組織21
• 2.3 主要試劑21-23
• 2.4 主要儀器23-25
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法25-31
• 3.1 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)25
• 3.2 Western blot（蛋白免疫印跡）25
• 3.3 普魯士藍(lán)染色（核固紅法）25-26
• 3.4 線粒體ROS檢測（MitoSOX?）26
• 3.5 線粒體螯合鐵檢測（RPA熒光探針）26
• 3.6 SiRNA干擾26-28
• 3.7 線粒體蛋白的提取28
• 3.8 H9c2大鼠心肌細(xì)胞肥大的檢測28-29
• 3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法29-31
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-59
• 4.1 Apelin-13誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞鐵超載31-32
• 4.2 Apelin-13誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞鐵自噬的發(fā)生32-35
• 4.3 NCOA4-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞鐵超載35
• 4.4 Apelin-13促進(jìn)H9c2細(xì)胞線粒體鐵超載及線粒體ROS生成35-38
• 4.5 Apelin-13促進(jìn)H9c2細(xì)胞中線粒體鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SFXN1的表達(dá)38-39
• 4.6 NCOA4-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的線粒體鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SFXN1表達(dá)39-40
• 4.7 SFXN1-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的線粒體鐵超載40-41
• 4.8 Apelin-13促進(jìn)H9c2細(xì)胞中線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶Tom70，Tom7的表達(dá)41-43
• 4.9 Tom7-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的線粒體鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SFXN1的表達(dá)43-44
• 4.10 Apelin-13促進(jìn)H9c2細(xì)胞中尾貓蛋白識別因子TRC40表達(dá)44-45
• 4.11 TRC40-siRNA抑制apelin-13促H9c2心肌細(xì)胞中線粒體轉(zhuǎn)錨定蛋白Tom7及SFXN1的表達(dá)45-46
• 4.12 Apelin-13誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞二價鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)體DMT1的表達(dá)46-47
• 4.13 Apelin-13激活A(yù)PJ促H9c2心肌細(xì)胞肥大47-48
• 4.14 鐵自噬-SFXN1介導(dǎo)apelin-13促心肌細(xì)胞肥大48-53
• 4.15 人尸檢心肌肥厚心臟組織中心肌肥大因子BNP, apelin，鐵自噬蛋白NCOA4以及線粒體鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SFXN1高表達(dá)，且表現(xiàn)出鐵沉積53-55
• 4.16 雙腎雙夾腎血管性高血壓大鼠模型引起心肌肥厚心臟組織中心肌肥大因子BNP, apelin，鐵自噬相關(guān)蛋白NCOA4，以及線粒體鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SFXN1高表達(dá)，，且表現(xiàn)出鐵沉積55-59
• 第5章 討論59-63
• 第6章 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 文獻(xiàn)翻譯72-84
• 綜述84-102
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果102-106
• 致謝106-107

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 潘偉男;李峰;毛小環(huán);秦旭平;鄧水秀;封芬;陳鋒;李蘭芳;廖端芳;陳臨溪;;14-3-3參與apelin-13促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖ERK1/2信號途徑研究(英文)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2011年12期

2 楊莉;陳臨溪;;Apelin/APJ系統(tǒng)對多個系統(tǒng)功能的調(diào)控作用[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2011年01期

3 李蘭芳;李峰;朱炳陽;廖端芳;陳臨溪;;雙腎雙夾易卒中型腎血管性高血壓大鼠重要靶器官ACE2表達(dá)研究[J];中國病理生理雜志;2007年05期

  本文關(guān)鍵詞：鐵自噬促Sideroflexin1依賴性線粒體鐵超載介導(dǎo)apelin-13誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：305780