第一部分重型血友病甲患者的基因診斷及發(fā)病機(jī)制研究【目的】血友病甲(Hemophilia A,HA)為一種X染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病,在男性人群中發(fā)病率為1/5000,女性患者極為罕見(jiàn)。患者自幼可有反復(fù)的關(guān)節(jié)出血,嚴(yán)重者可發(fā)生腦出血危及生命。根據(jù)血漿中凝血因子VIII活性(FVIII:C)的不同將其分為輕、中、重三型。目前針對(duì)本病的治療主要依賴濃縮凝血因子VIII替代治療,尤其對(duì)于重型血友病患者來(lái)說(shuō),治療費(fèi)用大,生活質(zhì)量差,所以對(duì)血友病患者家系及時(shí)進(jìn)行基因檢測(cè),及早的發(fā)現(xiàn)攜帶者,可以有效的減少血友病患兒的誕生�！痉椒ā繉�(duì)2009年至2014年期間在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血友病中心就診的43例重型血友病甲男性患者進(jìn)行FVIII基因突變的檢測(cè),其中用長(zhǎng)距離PCR法檢測(cè)22號(hào)內(nèi)含子倒位,雙管PCR法檢測(cè)1號(hào)內(nèi)含子倒位,以及FVIII基因26個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列的直接測(cè)序并將測(cè)序結(jié)果和NCBI基因庫(kù)(genebank)所公布的FVIII(NM.000132.3)基因序列進(jìn)比對(duì),尋找基因突變,并排除多態(tài)性�！窘Y(jié)果】43例患者中,21例患者發(fā)現(xiàn)22號(hào)內(nèi)含子倒位(占48.8%),1號(hào)內(nèi)含子突變未發(fā)現(xiàn)。余下22例患者均發(fā)現(xiàn)基因突變位點(diǎn),共有21種突變,其中點(diǎn)突變13例,小片段缺失7例(其中2例為同種突變),小片段插入2例;其中導(dǎo)致氨基酸錯(cuò)義突變5例,無(wú)義突變6例,移碼突變9例,剪接位點(diǎn)突變2例。其中7種基因突變國(guó)際上未見(jiàn)報(bào)到,為首次發(fā)現(xiàn)。分別為:c.214GT(E72X),c.215TC(F73S),IVS5+2GA(splicing),c.2519CG(S840X),c.3180del A(V1061Xfs),c.5639del A(N1880Tfs*3),c.6572del A(N2191Mfs*18)�！窘Y(jié)論】43例HA患者的基因分析表明FVIII基因突變具有明顯的異質(zhì)性,22號(hào)內(nèi)含子倒位是重型血友病A患者的主要突變方式。通過(guò)分析7例新的突變的發(fā)病機(jī)制,對(duì)血友病A發(fā)病機(jī)制的的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ),血友病甲攜帶者及孕婦進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷打下了基礎(chǔ)。第二部分重型血友病A患者凝血因子VIII抑制物檢測(cè)及其產(chǎn)生影響因素的分析【研究目的】血友病甲(Hemophilia A,HA)是由于凝血因子VIII(FVIII)基因缺陷,導(dǎo)致的血漿FVIII質(zhì)或量的異常而引起的一種X染色體連鎖的隱形遺傳性出血性疾病。目前本病主要治療方法為FVIII制劑的替代治療,而FVIII抑制物是血友病A患者反復(fù)輸注FVIII制劑后產(chǎn)生的一種同種抗體,有中和并完全滅活FVIII活性的作用,是血友病A患者發(fā)生的最嚴(yán)重的并發(fā)癥。近年來(lái)隨著血友病替代治療的不斷推廣,重型HA患者接受替代治療的強(qiáng)度較以往大大增加,因此抑制物的防治也越來(lái)越得到重視,在本研究中我們對(duì)2004年至2014年期間在我院確診的重型血友病患者進(jìn)行抑制物產(chǎn)生影響因素的分析,旨在指導(dǎo)臨床上重型血友病A患者的治療�！痉椒ā渴占�2009年至2014年期間在蘇州大學(xué)附屬一院血友病中心確診的43例重型血友病甲(HA)男性患者外周血樣本,運(yùn)用Nijmegen改良的Bethesda方法對(duì)43例患者進(jìn)行FVIII抑制物的檢測(cè)。進(jìn)一步分析患者抑制物的發(fā)生與首次接受替代治療的年齡、暴露日、FVIII基因突變類型因素的相關(guān)性。【結(jié)果】43例男性重型血友病A患者,首次接受替代治療的年齡1歲組的14例(32.6%),1~5歲組22例(51.2%),≥5歲組7例(16.3%)。暴露日10ED組的患者15例(34.9%),10~50ED組8例(18.6%),≥50ED組20(46.5%)例。43例患者中抑制物陽(yáng)性患者9例(占20.9%),中位抑制物滴度0.82BU(0~14BU),陰性患者34例(占79.1%)。FVIII基因突變類型中無(wú)效突變38例(88.4%),非無(wú)效突變5例(11.6%)。對(duì)43例接受過(guò)替代治療的重型血友病A患者進(jìn)行發(fā)生抑制物的單因素及多因素分析,在觀察的諸多因素中,包括首次替代治療年齡、暴露日及突變類型與患者是否出現(xiàn)抑制物差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�！居懻摗垦巡』颊咭种莆锂a(chǎn)生的影響因素眾多,如何能夠有效的減少抑制物的發(fā)生,仍然需要進(jìn)行不斷的大樣本研究。如能根據(jù)發(fā)生抑制物的危險(xiǎn)程度,對(duì)血友病患者進(jìn)行分層治療將會(huì)更加有意義。第三部分凝血因子IX酶催化區(qū)突變致女性血友病乙一例試驗(yàn)研究【研究目的】血友病乙(Hemophilia B,HB)是一種X連鎖隱性遺傳性出血性疾病,多為男性發(fā)病,女性血友病乙患者罕見(jiàn),本研究對(duì)一例女性血友病乙患者進(jìn)行表型和基因型分析,探討其發(fā)病機(jī)制�！痉椒ā繉�(duì)一例女性血友病乙先證者、其父母及其女兒進(jìn)行血漿部分活化凝血酶原時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT),血漿凝血因子IX活性(FIX:C),血漿凝血因子VIII活性(FVIII:C)測(cè)定,并進(jìn)行FIX抑制物活性測(cè)定;運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)先證者及其父母、女兒的FIX基因的所有外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析并尋找突變位點(diǎn);對(duì)先證者及其父母運(yùn)用多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測(cè)16個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行親子分析。用Western blot的方法檢測(cè)患者血漿中FIX蛋白含量。在HEK293細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒以及突變型/野生型雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,繼而使用Western blot的方法檢測(cè)細(xì)胞上清液及裂解液的FIX蛋白含量。通過(guò)PCR聯(lián)合甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Hha I酶切PCR產(chǎn)物的方法檢測(cè)ZNF261基因上的甲基化位點(diǎn),檢測(cè)患者是否存在X染色體非隨機(jī)失活�！窘Y(jié)果】先證者因頭部外傷后顱內(nèi)血腫入院,既往有產(chǎn)后出血過(guò)多及術(shù)后出血難止病史。父母非近親結(jié)婚,均無(wú)出血病史。先證者血漿APTT 62.2s,PT 13.9s,FIX:C 2%,FVIII:C148%,FIX抑制物陰性;患者父母、女兒血漿APTT、PT、FIX:C、FVIII:C均正常。FIX基因分析發(fā)現(xiàn),先證者FIX基因的8號(hào)外顯子存在T1108G(Phe314Cys)雜合突變,已排除基因多態(tài)性,且此突變國(guó)際上尚無(wú)報(bào)道;患者父母及女兒FIX基因測(cè)序結(jié)果均正常。STR分析證實(shí)先證者與其父母為親子關(guān)系�；颊哐獫{中存在FIX蛋白,與正常人相比無(wú)明顯差別。體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染野生型F9WT質(zhì)粒的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染F9MT(Phe314Cys)質(zhì)粒的細(xì)胞以及F9WT/F9MT雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,進(jìn)行比較,表達(dá)上清中及細(xì)胞裂解液中FIX蛋白的含量無(wú)明顯差別。X染色體非隨機(jī)失活實(shí)驗(yàn)證實(shí)患者來(lái)源于母親的X染色體發(fā)生了甲基化不能被酶切,而來(lái)源于父親的X染色體被完全酶切�！居懻摗垦巡∫覟閄染色體連鎖隱性遺傳性出血疾病,女性罕見(jiàn),女性發(fā)病機(jī)制主要是X染色體的非隨機(jī)失活、X染色體的結(jié)構(gòu)異�；騀IX基因的純合突變所致。先證者臨床特點(diǎn)及表型檢測(cè)結(jié)果符合血友病乙,基因分析結(jié)果證實(shí)先證者的FIX基因8號(hào)外顯子存在T36029G(Phe314Cys)雜合突變,突變位于酶催化區(qū)域,該突變導(dǎo)致患者血漿中FIX活性下降,但并未影響FIX蛋白的表達(dá)與分泌。患者父母體細(xì)胞檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)FIX突變,且患者來(lái)源于母親的X染色體完全甲基化失活,因此我們推測(cè)患者FIX雜合突變來(lái)源于父親的精原細(xì)胞突變。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R554.1
【部分圖文】：

2號(hào)內(nèi)含子倒位圖

倒位陰性的22例患者基因突變圖

Phe314Cys)表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)：以 PcDNA3.1F9WT 質(zhì)粒為 PCR 擴(kuò)增模板，設(shè)計(jì)：5'-GCTGGGGAAGAGTCTGCCACAAAGGGAGATCTCCCTTTGTGGCAGACTCTTCCCCAG-3'（劃?rùn)M線 定點(diǎn)誘變 ： PCR 反應(yīng)體系：總體積 20μl ，包 0.4μl,10μm 的上下游引物各 1μl，F(xiàn)9WT DNA 0μl，Phusion 酶 0.2μl（New England Biolabs 公司產(chǎn)品件為：98℃變性 30s，98℃變性 10 s，70.7℃退火 30 s；最后 72℃延伸 l0min。取 2μl 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在 0.圖 3-1 PcDNA3.1(-)表達(dá)載體
【參考文獻(xiàn)】

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1 劉敬忠,劉強(qiáng),梁燕,王立榮,ＧｕｉｔｙＮｏｚａｒｙ,肖白,朱章菱,周艷,劉亮,張晶,ＳｔｅｖｅＳ．Ｓｏｍｍｅｒ;重型血友病甲基因診斷新技術(shù)的研究及其應(yīng)用[J];高技術(shù)通訊;1998年09期

2 吳競(jìng)生;;凝血因子Ⅷ抑制物的診治進(jìn)展[J];血栓與止血學(xué);2013年02期

本文編號(hào)：2890340