研究背景 西洛他唑是1978年日本大冢制藥有限公司合成的抗血小板類化合物,1988年作為治療慢性動(dòng)脈閉塞癥的藥物在日本上市。隨著大型循證醫(yī)學(xué)證實(shí),西洛他唑可以顯著改善慢性動(dòng)脈閉塞癥引起的下肢潰瘍、疼痛、發(fā)冷和間歇性跛行等缺血性癥狀,1999年美國(guó)FDA批準(zhǔn)其作為治療穩(wěn)定性間歇性跛行的藥物上市。成為美國(guó)市場(chǎng)上第一個(gè)獲得作為治療該適應(yīng)癥的抗血小板聚集的藥物；在臨床上還被應(yīng)用于治療糖尿病等引起的外周血管性疾病。 西洛他唑是一種選擇性磷酸二酯酶3抑制劑,可抑制血小板及平滑肌內(nèi)磷酸二酯酶的水解,增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,具有抗血小板聚集及血管擴(kuò)張作用。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)西洛他唑有抗炎作用及抗平滑肌細(xì)胞增殖的作用,支架植入術(shù)后應(yīng)用西洛他唑可減少新生內(nèi)膜的增生和重構(gòu),有抗晚期血管再狹窄的作用。這些效應(yīng)將作為西洛他唑抗血小板效應(yīng)的補(bǔ)充且使之成為缺血性疾病獨(dú)特的重要治療。 一、西洛他唑?qū)?dòng)脈粥樣硬化中血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是常見的血管病變,是缺血性心腦血管疾病的常見原因,嚴(yán)重的危害著人類的健康。既往的觀點(diǎn)認(rèn)為,AS是機(jī)體脂質(zhì)代謝障礙的結(jié)果,隨著研究的深入,目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AS是血管炎癥性損傷的一種表現(xiàn),認(rèn)為AS是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生紊亂后的炎癥反應(yīng)及在此基礎(chǔ)上的損傷-修復(fù)過程。血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular Endothelial Cells, VEC)既是血管內(nèi)壁的一道機(jī)械屏障,又是一個(gè)具有高度活性的、位于血液和組織分界內(nèi)表面的人體最大的內(nèi)分泌器官。它具有細(xì)胞通透性、選擇性屏障、止血、抗凝、纖溶、血液傳輸和血管活性物質(zhì)代謝及調(diào)節(jié)血管運(yùn)動(dòng)張力、產(chǎn)生生長(zhǎng)因子、纖維基質(zhì)增生等作用,參與炎癥反應(yīng),影響血管發(fā)生、血管通透性及液體平衡等。在動(dòng)脈粥樣硬化早期階段,損傷部位活化的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)分泌黏附分子和化學(xué)趨化因子,如血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1),導(dǎo)致免疫細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集并遷移到血管壁內(nèi)膜。VCAM-1在早期粥樣硬化斑塊形成時(shí)起主要作用,并且MCP-1是慢性炎癥反應(yīng)的媒介,二者可使單核細(xì)胞黏附。另外,活性氧與TNF-α也參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。有研究表明細(xì)胞核因子-κB (NF-κB)激活基因在人類動(dòng)脈粥樣硬化的血管中表達(dá)增高。 作為一種新型的磷酸二酯酶3(PDE3)抑制劑,西洛他唑的基本作用是抗血小板聚集。它有許多額外的細(xì)胞作用靶點(diǎn)：可抑制PDE活性和阻礙環(huán)磷酸腺昔(cAMP)降解及轉(zhuǎn)化,可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成及血管阻塞；減少黏附分子的表達(dá)(如VCAM-1),抑制細(xì)胞因子釋放和起效(如MCP-1、PDGF和]NF-α等),具有抗炎和抗動(dòng)脈抗粥樣硬化的作用；此外,通過提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平擴(kuò)張血管,促進(jìn)血管內(nèi)皮恢復(fù)和抑制血管增生,提高組織灌注,對(duì)缺血性腦組織起神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)西洛他唑?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用,MATSUMOTO等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明西洛他唑能通過增加內(nèi)皮依賴性超極化因子的反應(yīng)來(lái)改善2型糖尿病大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能。進(jìn)一步的研究表明,西洛他唑可能通過ERK1/2和P38MAPK依賴途徑對(duì)抗由脂多糖介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。除此之外,西洛他唑還有抑制炎癥細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用及抑制內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的作用,MORI等發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)單核細(xì)胞cAMP的濃度,西洛他唑有抑制單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附的作用。 二、西洛他唑?qū)ρ芷交〖?xì)胞的作用血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)是血管壁的主要成分之一,是決定血管活性和血管構(gòu)型的重要因素。其增殖在動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄和高血壓等多種血管性疾病的形成機(jī)制中起著重要作用。在參與AS形成的細(xì)胞體系中,其中VSMC是增殖體系中最活躍的細(xì)胞。臨床及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)西洛他唑能夠抑制VSMC增殖及預(yù)防冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后血管再狹窄。西洛他唑可以抑制由不同的生長(zhǎng)因子,包括血小板衍生因子(PDGF)胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖反應(yīng),也可抑制由PI3GF誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細(xì)胞的增殖反應(yīng)。近年來(lái)的研究還顯示,血漿PAI-1的水平與冠心病、內(nèi)膜增生和再狹窄密切相關(guān),而西洛他嘩能通過各種機(jī)制包括下調(diào)TGF-B, JNK和P38信號(hào)途徑,抑制相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),從而起到抗血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。 三、西洛他唑?qū)z裂原活化蛋白激酶的作用 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族屬于高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,廣泛分布于真核生物胞漿中。MAPK信號(hào)通路是一條細(xì)胞外信號(hào)引發(fā)細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的重要途徑,在細(xì)胞形成、分化、生長(zhǎng)、增殖及凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。目前發(fā)現(xiàn)MAPK家族有四條信號(hào)通路：即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、p38MAPK和ERK5/BMK1通路。經(jīng)典的MAPK級(jí)聯(lián)反包括3個(gè)激活步驟MAPK激酶激酶(mitogen-activated protein kinase ki-nase kinase, MAPKKK)激活后磷酸化并激活MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MAP-KK),接著MAPKK通過雙重磷酸化鄰近的蘇氨酸和酪氨酸而激活MAPK,激活后的MAPK可由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)作用于靶目標(biāo)。大量事實(shí)表明MAPK也是西洛他唑的作用靶點(diǎn)。 研究目的 西洛他唑目前在臨床上廣泛應(yīng)用于血管性疾病包括缺血性心腦血管疾病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防,也是抗血小板藥物治療的基礎(chǔ)。已有大量臨床研究證實(shí),西洛他唑可減少與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)疾病的發(fā)生。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和血管平滑肌細(xì)胞增殖在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究旨在分別觀察西洛他唑?qū)w外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖及磷酸化P38MAPK絲裂原活化蛋白激酶表達(dá)的影響,以進(jìn)一步從細(xì)胞和分子水平上闡述西洛他唑?qū)?dòng)脈粥樣硬化血管的保護(hù)作用。 研究方法 1.96孔板上體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926,用終濃度為10、30、100、300umol/l的西洛他唑分別作用24小時(shí)并設(shè)立對(duì)照進(jìn)行比較,采用MTT法確定細(xì)胞的增殖狀態(tài)。 2.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926,用不同終濃度的西洛他唑(10.30、100、300umol/l)刺激24小時(shí)并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行比較,裂解細(xì)胞提取蛋白,考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定總蛋白濃度,利用P38磷酸化抗MAPK抗體的蛋白免疫印記法測(cè)定磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)。 3.在96孔板上體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞VSMC,用終濃度為10、30、100、300umol/l的西洛他唑分別作用24小時(shí)并設(shè)立對(duì)照進(jìn)行比較,采用CCK-8法確定細(xì)胞的增殖狀態(tài)。 4.體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞VSMC,用不同終濃度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小時(shí)并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行比較,裂解細(xì)胞提取蛋白,考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定總蛋白濃度,利用P38磷酸化抗MAPK抗體的蛋白免疫印記法測(cè)定磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)。 研究結(jié)果 1.采用MTT法確定人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖狀態(tài)：各組細(xì)胞增殖率分別為對(duì)照組0.909±0.012, CLZ10μmo/L組0.904±0.026; CLZ30μmol/L組0.851±0.023; CLZ100μmol/L組0.670±0.013; CLZ300μmol/L組0.651±0.036。統(tǒng)計(jì)分析顯示30μmol/L、100μ mol/L和300μ mol/L的CLZ分別能明顯抑制HUVECs的增殖(P0.05),并呈劑量依賴性。 2.西洛他唑?qū)θ四氺o脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)的影響： 以對(duì)照組的密度掃描結(jié)果為100,10μmol/L西洛他唑?qū)α姿峄疨38MAPK蛋白沒有明顯的作用(96.3±6.0, P0.05)。30μ mol/L100μ mol/L及300μmol/L的CLZ均能夠明顯抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表達(dá)(92.5±2.4,72.6±5.2,70.6±3.3,P0.05)。 3.采用CCK-8法確定大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖狀態(tài)： 各組細(xì)胞增殖率分別為對(duì)照組0.835±0.022, CLZ10μmo/L組0.830±0.017; CLZ30μmol/L組0.796±0.022; CLZ100μmol/L組0.605±0.003; CLZ300μmol/L組0.581±0.032。統(tǒng)計(jì)分析顯示100μmol/L和300μmol/L的CLZ分別能明顯抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖(P0.05)。 4.西洛他唑?qū)Υ笫笮刂鲃?dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)的影響： 以對(duì)照組的密度掃描結(jié)果為100,10μ mol/L,30μmol/L的西洛他唑?qū)α姿峄疨38MAPK蛋白沒有明顯的作用(99.8±2.4,99.8±3.8,P0.05)。100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能夠明顯抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表達(dá)(86.7±1.6,77.9±2.3,P0.05)。 研究結(jié)論 本研究提示西洛他唑通過部分抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中磷酸化P38MAPK蛋白的表達(dá)而對(duì)體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖產(chǎn)生一定的抑制作用,這一效應(yīng)可能是西洛他唑在缺血性心腦血管疾病治療中的重要機(jī)制,不僅是對(duì)西洛他唑應(yīng)用于外周血管疾病的重要補(bǔ)充,也是西洛他唑成為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R543.5
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 西洛他唑?qū)θ四氺o脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及磷酸化p38MAPK表達(dá)的影響
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
第二部分 西洛他唑?qū)Υ笫笱芷交〖?xì)胞增殖及磷酸化p38MAPK表達(dá)的影響
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
全文小結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間成果
致謝
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本文編號(hào)：2890285