發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 01:32

　　 背景:隨著社會(huì)的進(jìn)步,生活水平的提高,老齡化的加劇,代謝相關(guān)疾病和心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率越來(lái)越高,嚴(yán)重威脅人類健康。代謝和心血管系統(tǒng)疾病關(guān)系十分密切,而脂肪組織又是代謝過(guò)程中關(guān)鍵組織之一。因此,脂肪組織代謝的研究亟待進(jìn)行,能夠讓我們更清楚地了解代謝疾病的發(fā)生發(fā)展具體過(guò)程,明確脂肪代謝與心血管疾病的始動(dòng)關(guān)系,從而找到代謝性疾病治療的更好靶點(diǎn)。脂肪組織是人體儲(chǔ)存能量的重要組織,對(duì)胰島素反應(yīng)敏感,具有較強(qiáng)的攝取葡萄糖的能力;同時(shí),脂肪組織也是人體維持體溫的重要組織,特別是棕色脂肪組織,具有特征性非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱能力,對(duì)維持體溫有十分重要意義。在脂肪組織產(chǎn)熱的過(guò)程中,伴有脂降解過(guò)程,能夠顯著影響血脂,進(jìn)而影響心腦血管疾病的進(jìn)程。因此,脂肪組織的代謝情況可顯著影響全身代謝,對(duì)多種代謝相關(guān)疾病產(chǎn)生影響,如,代謝綜合征、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等。人體的脂肪組織分為兩種類型:白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)。白色脂肪組織細(xì)胞內(nèi)含有大脂滴,主要功能是儲(chǔ)存能量。棕色脂肪組織細(xì)胞內(nèi)含有豐富的線粒體和小脂滴,主要功能是產(chǎn)熱以維持體溫。除了作為能量倉(cāng)庫(kù)的功能之外,白色脂肪組織還能夠分泌多種脂肪因子,例如瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素、網(wǎng)膜素等等,參與各種代謝的調(diào)節(jié)。白色脂肪組織主要分布于皮下,腸系膜,腹膜后、附睪等部位。嚙齒類動(dòng)物的棕色脂肪組織主要分布于肩胛間區(qū)。以往認(rèn)為,人類只有在嬰兒時(shí)期有棕色脂肪組織,成年后消失。直到2009年的研究表明,成年人體內(nèi)也有棕色脂肪組織,主要分布于頸部?jī)蓚?cè)、鎖骨附近,脊柱周圍等位置。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及我們前期的研究發(fā)現(xiàn),低溫刺激可興奮交感神經(jīng),釋放兒茶酚胺類激素,通過(guò)與脂肪細(xì)胞表面的β3腎上腺素能受體結(jié)合,激活脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴蛋白和一系列酯酶等,加速脂降解過(guò)程。白色脂肪組織在這一過(guò)程中,顏色由白轉(zhuǎn)棕,稱之為棕色化,這種顏色的變化主要是由于脂肪細(xì)胞被激活,線粒體增多引起的。棕色化的白色脂肪組織和棕色脂肪組織能夠大量代謝自身或循環(huán)中的游離脂肪酸,進(jìn)行產(chǎn)熱,統(tǒng)稱為產(chǎn)熱脂肪。同時(shí),棕色脂肪和棕色化的白色脂肪對(duì)胰島素極為敏感,能夠大量攝取葡萄糖,起到調(diào)節(jié)代謝的功能。近年研究發(fā)現(xiàn),血脂中低密度脂蛋白膽固醇水平是動(dòng)脈粥樣硬化的高危因素。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),在ApoE-/-或Ldlr-/-脂代謝異常小鼠中,低溫環(huán)境能夠顯著促進(jìn)皮下白色脂肪脂降解,進(jìn)而提升血脂中低密度脂蛋白膽固醇水平,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,增加斑塊不穩(wěn)定性。以上結(jié)果提示,白色脂肪組織的激活,對(duì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展有非常大的影響。雖然低溫刺激和交感神經(jīng)興奮可以激活脂肪組織,但其作用范圍太廣泛,不適于更深入的機(jī)制研究及人體臨床研究,故而,更為精準(zhǔn)可控制的脂肪組織活化相關(guān)研究亟待進(jìn)行。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑也可以直接作用于脂肪細(xì)胞表面的β3腎上腺素能受體,激活脂肪組織。目前在歐美及日本的臨床上用于治療膀胱刺激征的藥物米拉貝隆(Mirabegron),是一種特異性β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑�，F(xiàn)有研究表明,正常劑量下,短期應(yīng)用米拉貝隆對(duì)心功能并無(wú)顯著影響。人體應(yīng)用4倍臨床劑量米拉貝隆的情況下,能夠激活棕色脂肪組織。但是長(zhǎng)期應(yīng)用米拉貝隆,其對(duì)脂肪組織的長(zhǎng)期激活作用,是否會(huì)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊產(chǎn)生影響,仍未見(jiàn)報(bào)道。為此,我們提出以下科學(xué)問(wèn)題:米拉貝隆作為β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑,對(duì)脂肪代謝有何影響?又是否對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生影響?研究目的:1.研究米拉貝隆對(duì)正常小鼠棕色和白色脂肪組織激活的影響2.研究米拉貝隆對(duì)正常小鼠脂肪組織微環(huán)境的影響3.研究米拉貝隆對(duì)正常小鼠生理及代謝指標(biāo)的影響4.研究米拉貝隆對(duì)ApoE-/-和Ldlr-/-脂代謝異常小鼠生理及代謝指標(biāo)的影響5.研究米拉貝隆對(duì)ApoE-/-和Ldlr-/-脂代謝異常小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用研究方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:正常小鼠采用野生型C57/BL6J品系8周齡雄性小鼠,脂代謝異常小鼠采用ApoE和Ldlr基因敲除8周齡雄性小鼠。均飼養(yǎng)于室溫。2.實(shí)驗(yàn)分組:野生型小鼠隨機(jī)分為3組,分別是溶劑對(duì)照組(vehicle)、米拉貝隆低劑量組(low)和米拉貝隆高劑量組(high)。均為普通飲食。對(duì)照溶劑或藥物每日灌胃一次,持續(xù)4周。ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組,分別是溶劑對(duì)照組(vehicle)、米拉貝隆低劑量組(low)和米拉貝隆高劑量組(high)。高脂高膽固醇飲食飼養(yǎng)8周,于第三周開(kāi)始進(jìn)行對(duì)照溶劑或藥物灌胃(每日一次),至第8周結(jié)束。Lddlr/-小鼠隨機(jī)分為3組,分別是溶劑對(duì)照組(vehicle)、米拉貝隆低劑量組(low)和米拉貝隆高劑量組(high)。高脂高膽固醇飲食飼養(yǎng)8周,于第三周開(kāi)始進(jìn)行對(duì)照溶劑或藥物灌胃(每日一次),至第8周結(jié)束。3.檢測(cè)指標(biāo):1)一般測(cè)量:平均攝食量、體重、體長(zhǎng)、心率、血壓等2)PET-CT掃描:小鼠饑餓過(guò)夜(8小時(shí)),麻醉后,腹腔注射約250μCi的18F-FDG。1小時(shí)后,進(jìn)行PET-CT掃描。3)呼吸代謝率測(cè)量:將小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后,置于呼吸代謝測(cè)量?jī)x器中進(jìn)行相應(yīng)測(cè)量。4)糖耐量檢測(cè):小鼠饑餓8小時(shí),腹腔注射葡萄糖,按時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血糖濃度。5)胰島素耐量檢測(cè):小鼠饑餓8小時(shí),腹腔注射胰島素,按時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血糖濃度。6)組織樣本取材:小鼠饑餓過(guò)夜,麻醉后取材。留取血清、各處脂肪組織,心臟、主動(dòng)脈、肝臟等組織。用于組化研究的組織浸泡于4%多聚甲醛中固定。用于分子檢測(cè)的組織浸泡于液氮中保存。7)血脂水平檢測(cè):檢測(cè)小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、游離脂肪酸等水平。8)組織學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色:脂肪組織和血管進(jìn)行相應(yīng)組織學(xué)染色,主要有HE染色觀察組織形態(tài)、油紅O染色檢測(cè)脂質(zhì)含量、天狼星紅染色觀察膠原水平。免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)脂肪組織內(nèi)脂滴包被蛋白、線粒體、炎癥浸潤(rùn)、血管等水平。9)Westernblot:檢測(cè)脂肪組織內(nèi)相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:定量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,兩組比較應(yīng)用雙側(cè)t檢驗(yàn),三組及以上應(yīng)用ANOVA檢驗(yàn)。設(shè)定p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:1.米拉貝隆能夠顯著激活脂肪組織。從對(duì)脂肪組織的分析中可以看出,米拉貝隆應(yīng)用后,脂肪組織體積顯著縮小,重量減輕,細(xì)胞直徑縮小,脂滴減小,擁有更豐富的線粒體,UCP1表達(dá)增加,代謝相關(guān)信號(hào)通路有明顯富集。這些證據(jù)表明,臨床劑量米拉貝隆可以顯著激活棕色脂肪組織,高劑量米拉貝隆可以顯著激活白色脂肪組織。2.米拉貝隆能夠提高小鼠胰島素敏感性和代謝水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,米拉貝隆能夠提高胰島素敏感性,提高呼吸代謝率,提示其激活脂肪組織后能夠顯著提升代謝水平。3.米拉貝隆能夠顯著促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積和不穩(wěn)定性。從對(duì)ApoE-/-和Ldlr-/-小鼠主動(dòng)脈染色等實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析來(lái)看,米拉貝隆能夠顯著增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積,增加斑塊不穩(wěn)定性和壞死核面積。結(jié)論:1.米拉貝隆可以顯著激活棕色脂肪組織2.米拉貝隆可以顯著促進(jìn)脂降解,增加ApoE-、-小鼠血中LDL-C水平3.米拉貝隆可以通過(guò)激活棕色脂肪組織,顯著加重ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變程度意義:第一部分:米拉貝隆是一種β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑,是臨床中治療膀胱刺激征的常用藥物。然而,這種藥物對(duì)非靶向組織和器官的影響尚有許多不明之處。在這項(xiàng)研究中,我們?yōu)槊桌惵】赏ㄟ^(guò)激活棕色脂肪,進(jìn)而加劇動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程,引發(fā)心腦血管疾病提供了新的機(jī)制見(jiàn)解。鑒于已有文獻(xiàn)報(bào)道,米拉貝隆可誘導(dǎo)成人受試者棕色脂肪活化,因此我們的研究發(fā)現(xiàn)具有極高的臨床相關(guān)性。此外,Ldlr的基因變異經(jīng)常發(fā)生在人群中(每300人中就有1人攜帶Ldlr變異)。如果這部分患者接受米拉貝隆治療,風(fēng)險(xiǎn)將很高。這一重要問(wèn)題尚未在臨床研究中探討,需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。背景:代謝綜合征對(duì)身體健康的影響越來(lái)越引起人們的注意。很多疾病都與代謝異常相關(guān),例如高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等。代謝過(guò)程中重要的一個(gè)方面是能量的代謝。能量主要包括葡萄糖和脂質(zhì),而脂肪組織是人體儲(chǔ)存能量的重要組織,同時(shí)對(duì)胰島素反應(yīng)敏感,具有較強(qiáng)的攝取葡萄糖的能力。同時(shí),脂肪組織的也是人體維持體溫的重要組織。在脂肪組織產(chǎn)熱的過(guò)程中,伴有脂降解過(guò)程,能夠顯著影響血脂,進(jìn)而影響心腦血管疾病的進(jìn)程。因此,脂肪組織的代謝情況可顯著影響全身代謝,對(duì)多種代謝相關(guān)疾病產(chǎn)生影響,如,代謝綜合征、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,低溫刺激可興奮交感神經(jīng),釋放兒茶酚胺類激素,激活脂肪細(xì)胞內(nèi)一系列酯酶等,加速脂降解過(guò)程。脂降解過(guò)程可以將甘油三酯降解為脂肪酸及甘油,釋放入血,供其他器官利用。其中肝臟可以利用其合成低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白。而血脂中低密度脂蛋白膽固醇水平是動(dòng)脈粥樣硬化的高危因素。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),在ApoE-/-和Ldlr-/-脂代謝異常小鼠中,4℃低溫環(huán)境能夠顯著促進(jìn)皮下白色脂肪脂降解,進(jìn)而提升血脂中低密度脂蛋白膽固醇水平,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,增加斑塊不穩(wěn)定性。在野生型小鼠中,4℃低溫僅僅能夠激活皮下白色脂肪,-10℃至-20℃低溫能夠顯著激活內(nèi)臟白色脂肪,進(jìn)一步提高代謝水平,并增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性。以上結(jié)果提示,脂肪組織的激活,對(duì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生和發(fā)展有非常大的影響。但是,皮下白色脂肪僅僅是白色脂肪的一部分,內(nèi)臟白色脂肪的激活對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變的作用仍未報(bào)道。為此,我們提出以下科學(xué)問(wèn)題:極低溫度下,內(nèi)臟白色脂肪被激活,對(duì)于脂代謝異常小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是否產(chǎn)生影響?研究目的:1.研究-10℃低溫對(duì)ApoE-/-脂代謝異常小鼠生理及代謝指標(biāo)的影響2.研究-10℃低溫對(duì)ApoE-/-脂代謝異常小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用研究方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:脂代謝異常小鼠采用ApoE基因敲除8周齡雄性小鼠。高脂高膽固醇飲食。2.實(shí)驗(yàn)分組:ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組,分別是30℃組、4℃組和-10℃組。均高脂飲食8周。30℃組直接置于30℃環(huán)境飼養(yǎng)8周,4℃組和-10℃組前3天置于18℃環(huán)境,4℃第4天至8周置于4℃環(huán)境飼養(yǎng),-10℃組第4至7天置于4℃環(huán)境飼養(yǎng),第2至8周每天置于-10℃環(huán)境飼養(yǎng)8小時(shí),置于4℃飼養(yǎng)16小時(shí)。3.檢測(cè)指標(biāo):1)一般測(cè)量:平均攝食量、體重、體長(zhǎng)、心率、血壓等2)呼吸代謝率測(cè)量:將小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后,置于呼吸代謝測(cè)量?jī)x器中進(jìn)行相應(yīng)測(cè)量。3)糖耐量檢測(cè):小鼠饑餓8小時(shí),腹腔注射葡萄糖,按時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血糖濃度。4)胰島素耐量檢測(cè):小鼠饑餓8小時(shí),腹腔注射胰島素,按時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血糖濃度。5)組織樣本取材:小鼠饑餓過(guò)夜,麻醉后取材。留取血清、各處脂肪組織,心臟、主動(dòng)脈、肝臟等組織。用于組化研究的組織浸泡于4%多聚甲醛中固定。用于分子檢測(cè)的組織浸泡于液氮中保存。6)血脂水平檢測(cè):檢測(cè)小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、游離脂肪酸等水平。7)組織學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色:脂肪組織和血管進(jìn)行相應(yīng)組織學(xué)染色,主要有HE染色觀察組織形態(tài)、油紅O染色檢測(cè)脂質(zhì)含量、天狼星紅染色觀察膠原水平。免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)脂肪組織內(nèi)脂滴包被蛋白、線粒體、炎癥浸潤(rùn)、血管等水平。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:定量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,兩組比較應(yīng)用雙側(cè)t檢驗(yàn),三組及以上應(yīng)用ANOVA檢驗(yàn)。設(shè)定p0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:1.極低溫度能夠顯著激活脂肪組織。從對(duì)脂肪組織的分析中可以看出,ApoE-/-小鼠在-10℃環(huán)境飼養(yǎng)一段時(shí)間后,內(nèi)臟白色脂肪組織體積顯著縮小,重量減輕,細(xì)胞直徑縮小,脂滴減小,擁有更豐富的線粒體,UCP1表達(dá)增加。這些證據(jù)表明,-10℃可以顯著激活內(nèi)臟白色脂肪組織。2.極低溫度能夠提高小鼠胰島素敏感性和代謝水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,-10℃環(huán)境能夠提高胰島素敏感性,提高呼吸代謝率,提示其激活脂肪組織后能夠顯著提升代謝水平。3.極低溫度能夠顯著促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積和不穩(wěn)定性。從對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈染色等實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析來(lái)看,米拉貝隆能夠顯著增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積,增加斑塊不穩(wěn)定性和壞死核面積。結(jié)論:1.極低溫度可以顯著激活內(nèi)臟白色脂肪組織2.極低溫度可以顯著促進(jìn)脂降解,增加ApoE-/-小鼠血中LDL-C水平3.極低溫度可以通過(guò)激活內(nèi)臟白色脂肪組織,顯著加重ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變程度意義:北方地區(qū)冬季嚴(yán)寒,極低溫度下人體脂肪被激活,對(duì)于有血脂代謝異常的人,更易發(fā)生心腦血管事件,這一發(fā)現(xiàn)表明了內(nèi)臟脂肪激活與動(dòng)脈粥樣硬化之間有重要聯(lián)系,提示寒冷地區(qū),對(duì)高危心血管事件需格外關(guān)注。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R543.5
【部分圖文】：

Ｍｉｒａｂｅｇｒｏｎ?Ｍｉｒａｂｅｇｒｏｎ?Ｍｉｒａｂｅｇｒｏｎ??圖１，米拉貝隆對(duì)野生型小鼠攝食量，體重、身體體重指數(shù)的影響??Ａ－Ｃ．對(duì)照溶劑或米拉貝隆不同劑量處理野生型小鼠４周后，測(cè)量小鼠均攝食量（Ａ）、體重（Ｂ）和身體體重指數(shù)（Ｃ）??ＮＳ：無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，＊＊ｐ＜０．０１，?＊＊＊ｐ＜０．００１??

Ｍｉｒａｂｅｇｒｏｎ??圖２，米拉貝隆對(duì)野生型小鼠心率和血壓的影響??Ａ．對(duì)照溶劑或米拉貝隆不同劑量處理野生型小鼠４周后，測(cè)量小鼠心Ｂ．對(duì)照溶劑或米拉貝隆不同劑量處理野生型小鼠４周后，測(cè)量小鼠血ｂｐｍ：次／分鐘，ｍｍＨｇ：毫米呆柱，ＳＢＰ：收縮壓，ＤＢＰ：舒張壓，ＭＡ

內(nèi)組織“誤認(rèn)為”葡萄糖進(jìn)行攝取。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給小鼠注射１８ｆ－ｆｄｇ??后，低劑量及高劑量米拉貝隆處理組小鼠的棕色脂肪攝�。保福妫妫洌缌烤�??顯著高于溶劑對(duì)照組，且攝取量與米拉貝隆劑量呈正相關(guān)（圖３Ｂ－Ｃ）。??這提示，小鼠的棕色脂肪在米拉貝隆刺激后，可更多地?cái)z取葡萄糖，即??處于激活狀態(tài)。繼之我們檢測(cè)了小鼠棕色脂肪組織和白色脂肪組織的重??量，結(jié)果顯示，白色脂肪重量隨米拉貝隆劑量的增加而降低（圖３Ｄ－Ｅ），??而棕色脂肪的重量在應(yīng)用米拉貝隆后顯著降低，但并無(wú)劑量依賴性（圖??３Ｆ）。證明脂肪組織在應(yīng)用米拉貝隆后顯著棕色化，攝取葡萄糖能力增加，??但本身重量顯著下降，證實(shí)脂肪組織應(yīng)用米拉貝隆后有明顯激活。??Ａ?Ｂ?Ｍｉｒａｂｅｇｒｏｎ?Ｃ?１５＿．??Ｍｉｒａｂｅｇｒｏｎ?Ｖｅｈｉｃｌｅ?…??ｌｏｗ?１１?丨?１??…Ｉ??Ｖｅｈｉｃｌｅ?ｌｏｗ?ｈｉｇｈ??，Ｉ｜Ｈ丨?ｄＨＢ?ＨＭＨ?ｏ?Ｍｉｒａｂｅｇｒｏｎ??Ｄ?．．．?Ｅ?Ｆ??０＇４＞｜?：?—Ｉ?０２５－，?｜?０．１５－

本文編號(hào)：2886914