背景:誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)是一種極具應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞,和胚胎干細(xì)胞相似,能夠在體內(nèi)外分化成各種成體細(xì)胞,是一種理想的治療心肌梗死的種子細(xì)胞,然而在缺血心肌組織中低下的存活率卻限制了其應(yīng)用。因此,我們合成出一種全新的可注射的基于葉酸的小分子水凝膠,并包裹iPS細(xì)胞進(jìn)行移植治療心肌梗死。目的:葉酸多肽水凝膠包裹iPS治療心肌梗死并其評價效果,探討葉酸多肽水凝膠作為可注射支架材料的可能,為iPS臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法和結(jié)果:1.使用固相合成法合成了基于葉酸的多肽分子FA-FFFRGDssEE,并檢測了其成膠性能。使用流變儀檢測其形成水凝膠的流變性質(zhì),透射電鏡觀察其微觀形貌;活-死細(xì)胞染色及CCK-8法檢測其生物相容性;心肌組織注射檢測水凝膠的體內(nèi)降解性。結(jié)果顯示,FA-FFFRGDssEE可以形成性能良好的水凝膠,并具備良好的生物相容性。2.以不依賴飼養(yǎng)層的方法培養(yǎng)iPS細(xì)胞,并以EB(擬胚體)法誘導(dǎo)iPS向心肌細(xì)胞分化。以qPCR方法檢測分化第0,3,5,7,11,15天OCT3/4,MESP1,ISL-1,GATA4,MYH6,cTnT,vWF基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,細(xì)胞的多能性標(biāo)志物,中胚層標(biāo)志物,祖細(xì)胞標(biāo)志物,心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)均隨時間規(guī)律變化,符合胚胎發(fā)育的進(jìn)程。分化的細(xì)胞中可以看到MYH6/cTnT和vWF染色陽性的細(xì)胞。隨后用CCK-8檢測了 iPS細(xì)胞在葉酸水凝膠(1.0 wt%,0.75 wt%,0.5 wt%)中的增殖,用活-死細(xì)胞染色觀察了 iPS細(xì)胞在水凝膠中的存活。結(jié)果顯示:iPS細(xì)胞在各個濃度葉酸水凝膠中的增殖和存活良好,無明顯差別。我們選取了力學(xué)強度最高的葉酸水凝膠(1.0wt%)進(jìn)行后續(xù)實驗。以qPCR和免疫熒光檢測了 iPS在l.Owt%葉酸水凝膠上的分化,結(jié)果顯示:iPS能在1.0Wt%葉酸水凝膠上正常分化為心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。我們又用流式細(xì)胞計數(shù)檢測了氧化應(yīng)激條件下,iPS在葉酸水凝膠中的凋亡情況。結(jié)果顯示:葉酸水凝膠明顯降低了 iPS在氧化應(yīng)激中的凋亡率。3.葉酸多肽水凝膠包裹iPS對小鼠心肌梗死進(jìn)行了移植治療,實驗分為5組:Sham 組,PBS 組,FAhydrogel 組,iPS 組,FAhydrogel+iPS 組。心梗后 28 天行心臟超聲示:FA hydrogel+iPS組的心功能改善最明顯。Masson染色示:FA hydrogel +iPS組心臟纖維化程度最小。免疫熒光示:FA hydrogel +iPS組的iPS細(xì)胞存活率更高。MYH6熒光染色示:iPS在小鼠心臟內(nèi)繼續(xù)分化為心肌細(xì)胞。vWF熒光染色示:FA hydrogel +iPS組梗死區(qū)的血管密度更高。Isolectin B4染色示:FAhydrogel+iPS組梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管密度更高。WGA染色示:FA hydrogel +iPS組心梗周邊區(qū)心肌細(xì)胞肥大程度最小。心梗區(qū)和周邊區(qū)組織qPCR結(jié)果示:FA hydrogel +iPS組VEGF和bFGF基因上調(diào)最多。結(jié)論:1.成功合成了基于葉酸的多肽分子FA-FFFRGDssEE,該多肽能自組裝形成穩(wěn)定透明的水凝膠,具有良好的生物相容性,體內(nèi)可降解,具備作為心肌組織工程可注射支架材料的條件。2.成功以iPS誘導(dǎo)分化出心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,且葉酸多肽水凝膠能夠很好地容納iPS的增殖,存活及分化,并能提高iPS細(xì)胞抗氧化損傷的能力。3.葉酸水凝膠聯(lián)合iPS移植有效改善了心梗小鼠的心功能,抑制了心室重構(gòu),增加了 iPS的滯留率,促進(jìn)新生血管形成。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

?第一部分葉酸多肽水凝膠的構(gòu)建與性能評價???—ｘ?ｘ?ａ：?ａ：?ａｃ?ａｔ?２?ａｔ?？－?ｆ?－?？－?ｒ－?ｒ－?＾?ｒ－?＾?ｖ?－?？?＊?？?＊?＃?＾?￣?－?？？＇？：ｒ，?ｒ－．?ｒ，?－．?ｒ．?－?．?／？?－ｉ?——?——???????，

１．０ｗｔ％Ｂ）０．７５ｗｔ％Ｃ）０．５ｗｔ％，頻率參數(shù)為?２ｒａｄ／ｓ，應(yīng)力參數(shù)為?１％??Ｆｉｇｕｒｅ．?１－４?Ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ?ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ｍｏｄｅ?ｏｆ?ｄｙｎａｍｉｃ?ｔｉｍｅ?ｓｗｅｅｐ?ａｔ?ｔｈｅ?ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ?ｏｆ?２??ｒａｄ／ｓ?ａｎｄ?ｓｔｒａｉｎ?ｏｆ?１％?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ｇｅｌｓ?ｏｆ?Ａ）?１．０?ｗｔ％，?Ｂ）?０．７５?ｗｔ％?ａｎｄ?Ｃ）?０．５?ｗｔ％?ｏｆ??ＦＡ－ＦＦＦＲＧＤｓｓＥＥ?ｗｉｔｈ?ｏｒ?ｗｉｔｈｏｕｔ?０．５ｘ?ｌ〇６／ｍｌ?ｃｅｌｌｓ．??究其原因，當(dāng)受到外加剪切力，多肽形成的纖維相互之間的交聯(lián)被打破，??不能形成良好的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此不能包裹住液體而變?yōu)檎吵淼牧黧w。而當(dāng)??外加的剪切力消失之后，纖維間的相互作用會慢慢恢復(fù)，從而回復(fù)為膠體；但??低濃度的水凝膠，一方面其形成的纖維較少，另一方面其纖維更細(xì)，當(dāng)外力破??壞了原有的交聯(lián)結(jié)構(gòu)之后，纖維之間難以重建有效的交聯(lián)，因而難以完全恢復(fù)??原有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。??２．４水凝膠的自組裝形貌??我們使用透射電鏡（ＴＥＭ）觀察ＦＡ－ＦＦＦＲＧＤｓｓＥＥ和ＦＡ－ＦＦＦｓｓ：ＥＥ水凝膠的??

（ＭＳＣｓ）進(jìn)行三維培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的不同時間點（１，３，５天）觀察其形貌，同時??用活－死細(xì)胞染色檢測細(xì)胞的存活。??其中，ＮＩＨ３Ｔ３細(xì)胞的培養(yǎng)如圖１－７所示，每一列為一個濃度的水凝膠在培??養(yǎng)細(xì)胞不同天數(shù)的活－死細(xì)胞染色照片。我們可以觀察到，第１天，細(xì)胞仍保持??比較規(guī)則的球形，并且在膠體中分布均勻，在三個不同濃度的水凝膠中，絕大??部分細(xì)胞的活力都很好（綠色圓點），死亡細(xì)胞較少（紅色小點）。第三天，??０．５?ｗｔ％?（濃度最低）的膠中，大多數(shù)細(xì)胞伸展為較短的梭形（ＮＩＨ３Ｔ３正常伸??展時即為梭形），表明細(xì)胞己經(jīng)開始鋪展。同時，濃度較大的兩個膠中也出現(xiàn)??了開始伸展的細(xì)胞，但是其數(shù)量較０．５０?ｗｔ％的膠少。第５天，三個濃度的膠中??大多數(shù)細(xì)胞都已呈現(xiàn)長梭形，表明細(xì)胞己經(jīng)充分伸展，此時死亡細(xì)胞仍只有少??數(shù)。以上結(jié)果表明
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本文編號：2885852