研究目的:探索1型蛋白磷酸酶Pleckstrin同源序列富亮氨酸重復(fù)片段蛋白磷酸酶(pleckstrin homology(PH)domain leucine-rich repeat protein phosphatase 1,PHLPP1)在急性心肌梗死(myocardial infarction,MI)及阿霉素導(dǎo)致的心肌損傷病理發(fā)展過程的凋亡、炎癥及纖維化中的作用及機(jī)制研究。研究方法:(1)選用8~12周野生型(Wild-type,WT)和PHLPP1 KO小鼠構(gòu)建冠狀動(dòng)脈左前降支永久結(jié)扎急性心肌梗死模型或腹腔注射阿霉素心肌損傷模型,記錄小鼠生存情況,第7天及第14天進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心功能指標(biāo),28天后處死小鼠取心臟組織進(jìn)行Masson染色比較WT和KO小鼠心肌組織纖維化程度。(2)選用8~12周WT和KO小鼠構(gòu)建急性心肌梗死模型,5天后處死小鼠采用TTC染色比較WT和KO小鼠心肌組織梗死面積。(3)選用8~12周WT和KO小鼠構(gòu)建阿霉素心肌損傷模型,第5天小鼠眼球取血測(cè)定血清乳酸脫氫酶(LDH)活性比較WT和KO小鼠心肌損傷程度,取心臟組織進(jìn)行TUNEL染色測(cè)定心肌組織中細(xì)胞凋亡水平。(4)選用8~12周WT和KO小鼠構(gòu)建急性心肌梗死模型或阿霉素心肌損傷模型,模型構(gòu)建后選擇適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)分離小鼠心臟,采用Western blot、qPCR方法比較WT和KO小鼠心臟組織中炎性因子、纖維化因子、自噬相關(guān)蛋白和Bcl-2家族凋亡相關(guān)蛋白的蛋白水平及mRNA水平。(5)分離WT和KO新生1~3天小鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),培養(yǎng)合適時(shí)間后進(jìn)行阿霉素刺激,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn):進(jìn)行流式細(xì)胞分析比較WT和KO小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平的差異,進(jìn)行PHLPP1及其靶蛋白Mcl-1的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究二者在細(xì)胞內(nèi)的相互作用,同時(shí)采用Western blot方法比較相同刺激時(shí)WT和KO小鼠心肌細(xì)胞Mcl-1蛋白水平的變化差異。(6)分離WT和KO新生1~3天小鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),培養(yǎng)合適時(shí)間后進(jìn)行阿霉素、蛋白翻譯抑制劑CHX及蛋白酶體抑制劑MG132干預(yù),WT和KO組分別分為4組,即DOX組,DOX+4h CHX組,DOX+8h CHX組,DOX+8h CHX及MG132組,采用Western blot方法比較Mcl-1蛋白水平的變化差異。結(jié)果:(1)PHLPP1缺陷減少急性心肌梗死誘導(dǎo)的小鼠死亡,減輕心肌損傷和纖維化的程度,改善心功能。(2)PHLPP1缺陷減少阿霉素誘導(dǎo)的小鼠死亡,減輕心肌損傷及心功能不全。(3)PHLPP1缺陷減少急性心肌梗死或阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡。(4)PHLPP1缺陷減少阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷后炎癥因子及纖維化因子表達(dá)的增加程度。(5)PHLPP1缺陷不影響心梗后心肌組織中的自噬水平。(6)PHLPP1缺陷上調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1的蛋白水平及其Thr163位點(diǎn)的磷酸化水平。(7)PHLPP1能夠直接結(jié)合Mcl-1,降低其Thr163位點(diǎn)的磷酸化水平,從而促進(jìn)Mcl-1蛋白酶體途徑的降解。結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明PHLPP1能夠通過直接結(jié)合Mcl-1降低心肌損傷所致的Thr163位點(diǎn)磷酸化水平的升高,從而促進(jìn)Mcl-1蛋白酶體途徑的降解,增加心肌細(xì)胞凋亡,加重心臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)了PHLPP1對(duì)心肌損傷調(diào)控的新機(jī)制,揭示了PHLPP1通過結(jié)合Mcl-1調(diào)控其Thr163位點(diǎn)磷酸化的過程,并以此解釋了PHLPP1加速M(fèi)cl-1降解的分子機(jī)制,為將來利用PHLPP1拮抗劑作為藥物治療缺血再灌注及阿霉素相關(guān)心肌損傷提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R542.2
【部分圖文】：

學(xué)位論文敲除小鼠的心肌梗死面積（圖 1B 下）相比對(duì)照野生型小asson 染色顯示心肌梗死后 28 天，PHLPP1 基因敲除小于野生型小鼠，表明心肌組織纖維化顯著減輕（圖 1C心功能指標(biāo)，如左心室射血分?jǐn)?shù)（Left Ventricular Eje室縮短分?jǐn)?shù)（Left Ventricular Fractional Shortening ，徑（Left ventricular internal diameter end systole，LVIDeft ventricular internal diameter end diastole ，LVIDd）、entricular End-Systolic Volume ，LVESV）和左心室舒張d-Diastolic Volume，LVEDV）均較野生型小鼠顯著改善臟收縮功能和舒張功能均優(yōu)于野生型小鼠。以上結(jié)果表肌梗死誘導(dǎo)的心肌損傷和心功能障礙，從而減少小鼠

PP1 缺陷減少阿霉素誘導(dǎo)的小鼠死亡，減輕心肌損傷及心 knockout recovers survival and alleviates cardiac injuryilatation after doxorubicin (Dox) treatment. A, Survival ofsham treatment (WT-sham, KO-sham) or Dox treatment (WTDH activity assessment of serum from mice 5 days after sham c systolic function and ventricular dilation shown by LVEd(mm), LVESV(μL) and LVEDV(μL) from transthoracic echoceline and 7,14 days after sham or Dox treatment. ** P<0.01, NLPP1 缺陷降低急性心肌梗死或阿霉素誘P1 缺陷能改善心�；虬⒚顾亟o藥后的心肌損傷程度心肌細(xì)胞的損傷包括凋亡密切相關(guān)，因此我們進(jìn)一

3. PHLPP1 缺陷降低心梗或阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡 knockout mitigates cardiac apoptosis after Dox treatmentuantification of terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPand KO mice hearts 5 days after sham or Dox treatment. *and quantification of WT and KO in vitro isolated primary ca<0.01.HLPP1 缺陷降低心肌損傷后炎癥因子及纖程度。阿霉素 1 周或 2 周后的小鼠取心臟組織，提取組織 R因子 mRNA 表達(dá)水平并比較 PHLPP1 基因缺陷與野錄水平有無(wú)差異，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHLPP1缺陷小鼠心
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本文編號(hào)：2884104