研究目的:探索1型蛋白磷酸酶Pleckstrin同源序列富亮氨酸重復片段蛋白磷酸酶(pleckstrin homology(PH)domain leucine-rich repeat protein phosphatase 1,PHLPP1)在急性心肌梗死(myocardial infarction,MI)及阿霉素導致的心肌損傷病理發(fā)展過程的凋亡、炎癥及纖維化中的作用及機制研究。研究方法:(1)選用8~12周野生型(Wild-type,WT)和PHLPP1 KO小鼠構(gòu)建冠狀動脈左前降支永久結(jié)扎急性心肌梗死模型或腹腔注射阿霉素心肌損傷模型,記錄小鼠生存情況,第7天及第14天進行超聲心動圖檢測小鼠心功能指標,28天后處死小鼠取心臟組織進行Masson染色比較WT和KO小鼠心肌組織纖維化程度。(2)選用8~12周WT和KO小鼠構(gòu)建急性心肌梗死模型,5天后處死小鼠采用TTC染色比較WT和KO小鼠心肌組織梗死面積。(3)選用8~12周WT和KO小鼠構(gòu)建阿霉素心肌損傷模型,第5天小鼠眼球取血測定血清乳酸脫氫酶(LDH)活性比較WT和KO小鼠心肌損傷程度,取心臟組織進行TUNEL染色測定心肌組織中細胞凋亡水平。(4)選用8~12周WT和KO小鼠構(gòu)建急性心肌梗死模型或阿霉素心肌損傷模型,模型構(gòu)建后選擇適當時間點分離小鼠心臟,采用Western blot、qPCR方法比較WT和KO小鼠心臟組織中炎性因子、纖維化因子、自噬相關蛋白和Bcl-2家族凋亡相關蛋白的蛋白水平及mRNA水平。(5)分離WT和KO新生1~3天小鼠的心肌細胞進行體外培養(yǎng),培養(yǎng)合適時間后進行阿霉素刺激,進行后續(xù)實驗:進行流式細胞分析比較WT和KO小鼠心肌細胞凋亡水平的差異,進行PHLPP1及其靶蛋白Mcl-1的免疫共沉淀實驗研究二者在細胞內(nèi)的相互作用,同時采用Western blot方法比較相同刺激時WT和KO小鼠心肌細胞Mcl-1蛋白水平的變化差異。(6)分離WT和KO新生1~3天小鼠的心肌細胞進行體外培養(yǎng),培養(yǎng)合適時間后進行阿霉素、蛋白翻譯抑制劑CHX及蛋白酶體抑制劑MG132干預,WT和KO組分別分為4組,即DOX組,DOX+4h CHX組,DOX+8h CHX組,DOX+8h CHX及MG132組,采用Western blot方法比較Mcl-1蛋白水平的變化差異。結(jié)果:(1)PHLPP1缺陷減少急性心肌梗死誘導的小鼠死亡,減輕心肌損傷和纖維化的程度,改善心功能。(2)PHLPP1缺陷減少阿霉素誘導的小鼠死亡,減輕心肌損傷及心功能不全。(3)PHLPP1缺陷減少急性心肌梗死或阿霉素誘導的心肌細胞的凋亡。(4)PHLPP1缺陷減少阿霉素誘導的心肌損傷后炎癥因子及纖維化因子表達的增加程度。(5)PHLPP1缺陷不影響心梗后心肌組織中的自噬水平。(6)PHLPP1缺陷上調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1的蛋白水平及其Thr163位點的磷酸化水平。(7)PHLPP1能夠直接結(jié)合Mcl-1,降低其Thr163位點的磷酸化水平,從而促進Mcl-1蛋白酶體途徑的降解。結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明PHLPP1能夠通過直接結(jié)合Mcl-1降低心肌損傷所致的Thr163位點磷酸化水平的升高,從而促進Mcl-1蛋白酶體途徑的降解,增加心肌細胞凋亡,加重心臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)了PHLPP1對心肌損傷調(diào)控的新機制,揭示了PHLPP1通過結(jié)合Mcl-1調(diào)控其Thr163位點磷酸化的過程,并以此解釋了PHLPP1加速Mcl-1降解的分子機制,為將來利用PHLPP1拮抗劑作為藥物治療缺血再灌注及阿霉素相關心肌損傷提供了有力的實驗依據(jù)。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R542.2
【部分圖文】：

學位論文敲除小鼠的心肌梗死面積（圖 1B 下）相比對照野生型小asson 染色顯示心肌梗死后 28 天，PHLPP1 基因敲除小于野生型小鼠，表明心肌組織纖維化顯著減輕（圖 1C心功能指標，如左心室射血分數(shù)（Left Ventricular Eje室縮短分數(shù)（Left Ventricular Fractional Shortening ，徑（Left ventricular internal diameter end systole，LVIDeft ventricular internal diameter end diastole ，LVIDd）、entricular End-Systolic Volume ，LVESV）和左心室舒張d-Diastolic Volume，LVEDV）均較野生型小鼠顯著改善臟收縮功能和舒張功能均優(yōu)于野生型小鼠。以上結(jié)果表肌梗死誘導的心肌損傷和心功能障礙，從而減少小鼠

PP1 缺陷減少阿霉素誘導的小鼠死亡，減輕心肌損傷及心 knockout recovers survival and alleviates cardiac injuryilatation after doxorubicin (Dox) treatment. A, Survival ofsham treatment (WT-sham, KO-sham) or Dox treatment (WTDH activity assessment of serum from mice 5 days after sham c systolic function and ventricular dilation shown by LVEd(mm), LVESV(μL) and LVEDV(μL) from transthoracic echoceline and 7,14 days after sham or Dox treatment. ** P<0.01, NLPP1 缺陷降低急性心肌梗死或阿霉素誘P1 缺陷能改善心梗或阿霉素給藥后的心肌損傷程度心肌細胞的損傷包括凋亡密切相關，因此我們進一

3. PHLPP1 缺陷降低心梗或阿霉素誘導的心肌細胞的凋亡 knockout mitigates cardiac apoptosis after Dox treatmentuantification of terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPand KO mice hearts 5 days after sham or Dox treatment. *and quantification of WT and KO in vitro isolated primary ca<0.01.HLPP1 缺陷降低心肌損傷后炎癥因子及纖程度。阿霉素 1 周或 2 周后的小鼠取心臟組織，提取組織 R因子 mRNA 表達水平并比較 PHLPP1 基因缺陷與野錄水平有無差異，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHLPP1缺陷小鼠心
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本文編號：2884104