心血管疾病導(dǎo)致心源性猝死,是人類死亡的主要原因之一。心律失常是導(dǎo)致心源性猝死的直接原因。心律失常分為室性纖顫/室性心動過速和房顫。心律失常主要是由于心肌細胞離子流的異常所致,而離子通道控制著離子流。離子通道的基因突變導(dǎo)致遺傳性心律失常。例如,1995年首次報道了鈉通道Na_v1.5的基因突變導(dǎo)致心律失常疾病長QT綜合征的發(fā)生。電壓門控鈉離子通道Na_v1.5對心臟動作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)都起著非常關(guān)鍵的作用。Na_v1.5的α亞基,由SCN5A基因編碼。目前已發(fā)現(xiàn)300多個SCN5A的遺傳突變,導(dǎo)致Brugada綜合征,長QT綜合征、病態(tài)竇房結(jié)綜合征,擴張性心臟病等。Na_v1.5是一個大的蛋白質(zhì)復(fù)合體,由?-亞基,?-亞基和許多其它相互作用蛋白如MOG1等組成,但是Nav1.5蛋白質(zhì)復(fù)合體的關(guān)鍵組成成分及每個組份調(diào)控Nav1.5的表達和功能的機制還有待深入研究。作為膜蛋白,Na_v1.5在細胞膜表面的表達水平和它的功能息息相關(guān),因為細胞的電活動不僅依賴于它的活性還依賴于它的表達水平。Na_v1.5的泛素化在控制其膜表達量方面起著重要的作用,UPS(ubiquitin-proteasome system)系統(tǒng)的關(guān)鍵組分Nedd4-2和Na_v1.5相互作用并調(diào)控Na_v1.5的泛素化、內(nèi)吞和降解。Nedd4-2是含有HECT催化結(jié)構(gòu)域的泛素E3連接酶,Na_v1.5包括PY(xPPxY)基序,可以和Nedd4-2的WW結(jié)構(gòu)域相互作用,泛素化是質(zhì)膜蛋白內(nèi)吞和降解的前提條件。SUMO化是另一種翻譯后蛋白質(zhì)修飾,對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性其重要作用。UBC9是SUMO化的結(jié)合酶E2,與E3酶相互作用,在SUMO化修飾過程中幫助SUMO連接在底物蛋白上。Na_v1.5的SUMO化修飾未有報道,因此我們原計劃研究SUMO化對Na_v1.5的影響。我們在HEK293-Na_v1.5細胞中過表達UBC9,我們發(fā)現(xiàn)UBC9的可以調(diào)控Na_v1.5的表達量和心臟鈉電流密度,但是我們意外的發(fā)現(xiàn),UBC9不是通過SUMO化修飾,而是通過調(diào)控Na_v1.5的泛素化從而控制Na_v1.5表達與功能。具體實驗結(jié)果如下:(1)我們無論是在HEK293細胞中共轉(zhuǎn)Na_v1.5/UBC9和Na_v1.5/pCMV-HA,還是在Na_v1.5穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系HEK293-Na_v1.5分別轉(zhuǎn)染UBC9過表達質(zhì)粒和空載,結(jié)果表明過表達UBC9下調(diào)了Nav1.5的表達水平。實驗進一步表明,UBC9對Nav1.5的調(diào)控具有劑量依賴性。細胞膜上的Na_v1.5發(fā)揮著鈉通道的主要功能,過表達UBC9后,提取膜蛋白,結(jié)果表明,過表達UBC9下調(diào)細胞膜上的Nav1.5的表達水平;(2)我們在HEK293-Na_v1.5細胞中過表達UBC9,經(jīng)全細胞膜片鉗技術(shù)檢測,結(jié)果表明,過表達UBC9減小鈉電流密度,但并不影響鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活,穩(wěn)態(tài)失活以及失活后恢復(fù)的動力學(xué)參數(shù);(3)HEK293-Nav1.5細胞中用UBC9 siRNA干擾掉內(nèi)源性UBC9,結(jié)果表明敲低UBC9后,Nav1.5上調(diào)。進一步研究表明在HEK293-Na_v1.5細胞中敲除內(nèi)源性UBC9后,鈉電流密度增大,但并不影響鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活,穩(wěn)態(tài)失活以及失活后恢復(fù)的動力學(xué)參數(shù);(4)在大鼠乳鼠心肌細胞中過表達和敲除UBC9,記錄全細胞鈉電流,結(jié)果顯示,在乳鼠心肌細胞中,過表達UBC9減小鈉電流密度,干擾UBC9增大鈉電流密度;(5)我們構(gòu)建了喪失SUMO結(jié)合活性的UBC9突變體UBC9 C93S,用已知的SUMO底物p53作為被修飾的目的蛋白,檢測過表達UBC9和UBC9 C93S對p53的SUMO化影響,結(jié)果顯示,過表達UBC9促進了p53的SUMO化,突變體UBC9 C93S抑制了p53的SUMO化。證明我們的UBC9系統(tǒng)是有效的。我們用UBC9及UBC9 C93S分別與Na_v1.5共轉(zhuǎn),結(jié)果表明,過表達UBC9下調(diào)Na_v1.5,突變體UBC9 C93S同樣下調(diào)Na_v1.5的表達水平,因此,我們的結(jié)果表明UBC9對Na_v1.5的表達調(diào)控以獨立于SUMO化修飾的方式;(6)過表達UBC9后,Nav1.5下調(diào),蛋白酶體抑制劑MG132抑制了UBC9對Na_v1.5的下調(diào)作用,同時,在HEK293細胞中和HEK293-Na_v1.5細胞中過表達UBC9促進了Na_v1.5的泛素化;(7)免疫共沉淀實驗表明UBC9和Nedd4-2相互作用。以上研究表明,UBC9與Nedd4-2相互作用,通過泛素蛋白酶體途徑調(diào)控Na_v1.5的泛素化與降解,并且在異源性HEK293細胞和大鼠乳鼠心肌細胞中,調(diào)控Na_v1.5鈉電流密度。研究已經(jīng)證實,在調(diào)控Na_v1.5的泛素化系統(tǒng)中,Nedd4-2作為泛素E3連接酶調(diào)控Na_v1.5的泛素化與降解,但是該系統(tǒng)中的關(guān)鍵組分泛素E2結(jié)合酶還沒有被發(fā)現(xiàn),而我們的研究結(jié)果表明,UBC9可能作為泛素E2結(jié)合酶調(diào)控Na_v1.5的泛素化。我們的研究結(jié)果鑒定出一個Na_v1.5泛素化修飾系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)組份,為研究Na_v1.5的泛素化調(diào)控機制提供了重要的信息。對泛素系統(tǒng)各個組份的剖析對我們理解心臟鈉通道復(fù)合體的結(jié)構(gòu),功能和調(diào)控非常重要,對研究心血管生理學(xué),健康和疾病有著重要的意義。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

圖 1-1 心臟鈉通道 Nav1.5 的結(jié)構(gòu)圖Figure1-1 The structure of cardiac sodium channel Nav1.5Nav1.5 的半衰期起始于它的基因的轉(zhuǎn)錄，RNA 的剪接與在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的合成。從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Nav1.5 通過分泌途徑到達肌纖維膜發(fā)揮功能。Nav1.5 被轉(zhuǎn)錄修飾后，錨定在細胞骨架，儲存在亞細胞組份，然后組裝成多蛋白復(fù)合體，最后 Nav1.5 從它的膜的位置發(fā)生內(nèi)吞然后被降解。雖然目前對這三個事件的時間尺度知之甚少，但是研究表明在狗的心臟中，Nav1.5 的半衰期是 32-36 h[37]。和大部分膜蛋白一樣，有很多和 Nav1.5 相互作用的蛋白，調(diào)控 Nav1.5 的表達與功能[28, 31]。這些蛋白主要是錨定蛋白和通過轉(zhuǎn)錄后修飾和通道相互作用的蛋白。這些轉(zhuǎn)錄后修飾蛋白在調(diào)控心臟鈉通道 Nav1.5 的生理學(xué)和病理學(xué)方面起著至關(guān)重要的作用，致使胞內(nèi)興奮信號的傳導(dǎo)。而 Nav1.5 的 β 亞基目前研究只發(fā)現(xiàn)了 N 端的糖基化修飾[38]。心肌 Nav1.5 通道的轉(zhuǎn)錄后修飾不僅維持著基本的心臟功能，而且一些化

10圖 1-2 人心臟鈉通道 Nav1.5 和 Navβ1 亞基的轉(zhuǎn)錄后修飾位點。（A）使用算法/體外分析得到的修飾位點，（B）從心臟組織的蛋白質(zhì)組分析得到的修飾位點[45]Figure 1-2 Localization of post-translational modification sites on the human cardiacNav1.5 and Navβ1 channel subunits. Findings obtained using in silico and/or in vitroanalyses (A) and native proteomic analyses from cardiac tissues (B) are compared directly[45].

圖 2-1 真核表達載體 pCMV-HA 圖譜Figure 2-1. Map of mammalian expresison vector pCMA-HA. DNA 片段與載體連接切回收后的 UBC9 DNA 片段和載體 pCMV-HA，測定濃度后，按的摩爾比為 3:1 的比例，用 T4 連接酶（Fermentas）進行連接反應(yīng)，BC9 DNA 片段 5 μlMV-HA 載體 2 μl4 DNA ligase 1 μl4 DNA ligase Buffer 1 μlH2O 1 μl4 ℃酶連過夜。 制備大腸桿菌（E.coli）DH-5α感受態(tài)細胞
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本文編號：2883798