目的:阿司匹林作為一種有效的抗血小板藥物,已廣泛應(yīng)用于心肌梗死、腦卒中等多種心血管疾病的預(yù)防和治療,但在鹽敏感性高血壓中的作用目前仍不清楚。鹽敏感性高血壓發(fā)病機制復(fù)雜,與腎臟排鈉障礙、交感神經(jīng)興奮性增加以及免疫系統(tǒng)異常等相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn),血小板異�；罨軌蛲ㄟ^誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與內(nèi)皮功能損傷、血管硬化和血管炎癥等血管病變,可能促進鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展。臨床研究也發(fā)現(xiàn),鹽敏感性高血壓患者體內(nèi)血小板活性增強。本研究旨在探討阿司匹林是否能夠通過抑制血小板異常活化參與鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展,并探討阿司匹林的作用機制,以期為鹽敏感性高血壓及其靶器官損傷的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點。方法:在體實驗:SPF級雄性鹽敏感性高血壓大鼠(Dahl salt-sensitive rat,,DSS)及其對照血壓鹽耐受性大鼠(SS-13BN)分別以正常鹽(Normalsalt,NS,0.4%NaCl)、高鹽(High salt,HS,8%NaCl)以及高鹽合并阿司匹林(High salt+Aspirin,HS+ASA,10mg/kg/d)喂養(yǎng)8周,期間采用尾袖法連續(xù)測量血壓(3次/周),實驗結(jié)束后采用頸總動脈插管校正大鼠動脈血壓(Blood pressure,BP);流式細胞術(shù)檢測外周血中血小板的活化率、白細胞-血小板聚集率、以及白細胞浸潤血管的百分率;尾血測定實驗以及血小板膠原靜態(tài)黏附實驗檢測血小板活化情況;免疫組化和HE染色檢測腎臟白細胞浸潤情況以及腎臟病理結(jié)構(gòu)改變;使用Power-lab系統(tǒng)進行乙酰膽堿(Acetylcholine,Ach)依賴的血管收縮以及舒張功能的檢測;Western blot檢測血管功能相關(guān)性蛋白eNOS、iNOS、vWF、ET-1的表達以及腎臟炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測外周血清中可溶性血栓素TXA2的表達量情況;Real-time PCR檢測IL-6、IL-1β、TNF-α的表達量以及血小板中COX-1、COX-2的mRNA的表達;利用蛋白組學(xué)分析的方法檢測不同的飲食處理對DSS大鼠血小板蛋白表達的影響。細胞實驗:體外分離并富集大鼠的外周血白細胞以及血小板,使用熒光染料BCF-AM對白細胞進行染色,分別用阿司匹林、COX-1抑制劑、COX-2抑制劑對血小板進行預(yù)處理,將染色的白細胞和預(yù)處理過的血小板分別與正常鹽(133 mM NaCl)、高鹽(173 mM NaCl)環(huán)境的下肺微血管內(nèi)皮細胞(PMVEC)共孵育,通過熒光倒置顯微鏡觀察白細胞和內(nèi)皮細胞的黏附情況。結(jié)果:DSS大鼠經(jīng)高鹽喂養(yǎng)之后,血壓較正常鹽組顯著升高,阿司匹林干預(yù)之后血壓與高鹽組相比顯著降低(P0.05),而SS-13BN大鼠在不同處理(正常鹽、高鹽、高鹽加阿司匹林)下血壓無明顯變化;流式細胞結(jié)果顯示,高鹽組DSS大鼠外周血的血小板活化率顯著增加,白細胞與血小板聚集率較對照組顯著增加,阿司匹林灌胃之后,血小板的活化以及與白細胞的聚集率恢復(fù)至對照組水平(P0.05);免疫組化結(jié)果顯示,高鹽飲食增加了腎臟白細胞的浸潤,阿司匹林干預(yù)能夠顯著改善上述情況;血管功能檢測結(jié)果顯示,高鹽飲食之后,DSS大鼠血管收縮和舒張功能明顯減弱,而阿司匹林處理之后能夠有效改善血管功能(P0.05);流式結(jié)果顯示高鹽組較正常鹽相比,DSS大鼠血管白細胞浸潤增加,蛋白印跡結(jié)果顯示血管vWF、ET-1、iNOS表達量顯著增加、血管eNOS表達量明顯減少,高鹽加阿司匹林組較高鹽組相比能夠有效降低血管白細胞浸潤,抑制血管vWF、ET-1、iNOS表達量的增加,能夠使eNOS的表達恢復(fù)正常。Real-time PCR結(jié)果顯示,高鹽組DSS大鼠較正常鹽組DSS大鼠腎臟炎癥因子表達水平顯著升高,阿司匹林處理之后能夠降低高鹽引起的炎癥因子的升高。蛋白組學(xué)結(jié)果顯示高鹽飲食激活了血小板內(nèi)的凝血和補體途徑,而高鹽的同時給予阿司匹林干預(yù),能夠有效抑制DSS大鼠血小板內(nèi)的凝血補體途徑的激活,從而抑制血小板的活化和功能。結(jié)論:低劑量阿司匹林可通過抑制血小板內(nèi)COX-1的活性以及補體凝血途徑的激活,抑制血小板活化,減少外周血中血小板和白細胞的聚集,減少炎癥細胞向腎臟及血管組織的浸潤,減輕腎臟炎癥反應(yīng)及血管內(nèi)皮功能障礙,進一步改善DSS大鼠由高鹽飲食誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓的發(fā)生與發(fā)展。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R544.1
【部分圖文】：

降低ＤＳＳ大鼠由高鹽飲食引起的血小板Ｐ－選擇素水平的增加（Ｐ?＜０．０５）。在ＳＳ－??１３ＢＮ大鼠中，正常鹽組以及高鹽組中的可釋放的血小板Ｐ－選擇素水平比ＤＳＳ大鼠??低得多，并且阿司匹林干預(yù)似乎對血小板Ｐ－選擇蛋白的釋放沒有顯著影響（圖２Ａ??和２Ｂ）。另外，我們還進行了尾血測定實驗來檢測大鼠體內(nèi)血小板活化情況。結(jié)果??顯示，三組大鼠在出血時間上無明顯差異，即正常鹽組為３６８．８±２０．７秒，高鹽組為??３７８±２９．１秒，高鹽＋阿司匹林組為３５９±１８．９秒（圖２Ｃ）。但是，進行高鹽飲食的ＤＳＳ??大鼠的血凝塊穩(wěn)定時間（３２６±１９．７秒）要比正常鹽飲食的ＤＳＳ大鼠（１９９±１９．６秒）??更長，而阿司匹林干預(yù)使得ＤＳＳ大鼠的血凝塊穩(wěn)定時間（１８７±２１秒）恢復(fù)至對照??組的水平（圖２Ｃ）。此外，血小板膠原靜態(tài)黏附實驗也表明，高鹽飲食使得血小板??活化度增強，其與固定化膠原之間的粘附顯著增加，通過阿司匹林干預(yù)后黏附明顯??減少（圖２Ｄ）。以上結(jié)果均證實了阿司匹林能夠抑制ＤＳＳ大鼠外周血中由高鹽飲食??引起的血小板異�；罨M而減少了血小板與膠原之間的黏附。但血液學(xué)分析結(jié)果??顯示

同的飲食處理似乎對它們的浸潤情況沒有明顯影響（補充數(shù)據(jù)圖２）。另外，透射??電子顯微鏡（ＴＥＭ）所觀察的結(jié)果也顯示，來自正常鹽組和阿司匹林組的ＤＳＳ大鼠??的主動脈有著完整的內(nèi)皮層（圖４Ｃ）但是高鹽組的ＤＳＳ大鼠的主動脈內(nèi)皮層遭到??破壞，顯示出變形的內(nèi)皮細胞形態(tài)以及浸潤的白細胞（圖４Ｃ），同時，高鹽飲食也??增加腎臟中炎性因子ＩＬ－１（３，?ＩＬ－６和ＴＮＦ－ａｍＲＮＡ?（圖４Ｅ）和蛋白質(zhì)（圖４Ｆ和４Ｇ）??在腎中的表達，使用阿司匹林進行干預(yù)后，腎臟中炎癥因子（ＩＬ－ｉｐ，ＩＬ－６、ＴＮＦ－ａ）??在基因水平以及蛋白水平的表達均恢復(fù)至正常水平。??Ａ?ＮＳ?ＨＳ?ＨＳ＋ＡＳＡ??一?？?＊■?一？？?＊?ｉ??’?Ｉ，■?－?ｄ?＃?－?ＮＳ?ＨＳ?ｈｓ＋ａｓａ??＋?！?￣＊?．?１?￣￣?＾?＊?ＦＴＴＣ－ＣＤ３ｅ＋??ｉ〇Ｔｆ〇?ｉｎｐｒ￡：：ｉ??？?＂?■?工??Ｐ？ｒ｜？－ｃｙ５．５?ＣＤ４５＋?＋?■—?二???３??｜?＾?－??？■?？，?？＊?－？?Ｊ?－

圖５．阿司匹林改善了?ＤＳＳ大鼠由高鹽飲食引起的血管功能障礙。??Ｆｉｇｕｒｅ?５．?Ａｓｐｉｒｉｎ?ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ?ｔｈｅ?ｖａｓｃｕｌａｒ?（ａｏｒｔａ）?ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ?ｃａｕｓｅｄ?ｂｙ?ＨＳ?ｄｉｅｔ?ｉｎ?ＤＳＳ?ｒａｔｓ??Ａ．使用Ｐｏｗｅｒ－Ｌａｂ系對由乙酰膽堿（Ａｃｈ）誘導(dǎo)的血管舒張進行定量檢測，正常鹽組（ＮＳ，ｎ?＝??５），高鹽組（ＨＳ，?ｎ＝５），高鹽＋阿司匹林組（ＨＳ＋ＡＳＡ，ｎ＝５）。Ｂ．使用透射電子顯微鏡（ＴＥＭ）??對ＤＳＳ大鼠主動脈進行成像。ＥＣ：內(nèi)皮細胞；ＳＭＣ：平滑肌細胞；ＩＥＬ，內(nèi)彈性薄層，標(biāo)尺：２??呵。Ｃ－Ｄ．?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?（免疫印跡）檢測ＤＳＳ大鼠主動脈血管損傷標(biāo)志物的表達，ｅＮＯＳ：內(nèi)皮型??一氧化氮合酶；ｉＮＯＳ：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；使用ＧＡＰＤＨ蛋白對結(jié)果進行校正，＊Ｐ＜０．０１，??高鹽組ｖｓ正常鹽組，＃Ｐ＜０．０５，高鹽組ｖｓ高鹽＋阿司匹林組。（ｎ?＝?６只／組）。結(jié)果均表不為平??均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，并使用單因素方差分析的方法進行結(jié)果統(tǒng)計。??Ａ．?Ｖａｓｃｕｌａｒ?ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｂｙ?Ａｃｈ?ｗａｓ?ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?Ｐｏｗｅｒ－Ｌａｂ?ｓｙｓｔｅｍ?（ｎ＝５）．?Ｂ．?Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ??ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ?（ＴＥＭ）?ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎ?ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ｔｈｏｒａｃｉｃ?ａｏｒｔａ?ｏｆ?ＤＳＳ?ｒａｔｓ?ｆｅｄ?ＮＳ，?ＨＳ，?ｏｒ?ＨＳ?ａｎｄ??ａｓｐｉｒｉｎ?（ＡＳＡ）．?ＥＣ，?ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ?ｃｅｌｌｓ；?ＳＭＣ，?ｓｍｏｏｔｈ?ｍｕｓｃｌｅ?ｃｅｌｌｓ；?ＩＥＬ，?
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本文編號：2880908