目的心房顫動(dòng)(房顫,AF)的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,包括炎癥,氧化應(yīng)激及鈣穩(wěn)態(tài)異常等。黃嘌呤氧化酶(XO)是嘌呤代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶,其過(guò)度激活可使體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。在本研究中,我們探討了氧化應(yīng)激和鈣調(diào)控異常與心房電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)的關(guān)系,以及黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇對(duì)以上病理過(guò)程的干預(yù)作用。方法本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分應(yīng)用了兩種糖尿病動(dòng)物模型:糖尿病兔模型和糖尿病大鼠模型。將90只成年大耳白兔隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(C,n=30),糖尿病組(DM,n=30)及別嘌呤醇干預(yù)組(ALLO,n=30),以四氧嘧啶溶液經(jīng)兔耳緣靜脈注射建立糖尿病兔模型。將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(n=30),糖尿病組(n=30)及別嘌呤醇干預(yù)組(n=30),以鏈脲佐菌素經(jīng)大鼠尾靜脈注射建立糖尿病大鼠模型。別嘌呤醇干預(yù)組在糖尿病模型建立成功后開始給藥,藥物干預(yù)時(shí)間為8/6周。在糖尿病兔/大鼠模型建立成功8/6周后,對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行在體心臟超聲檢查及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè),取血清及組織標(biāo)本,測(cè)定血清氧化應(yīng)激指標(biāo),包括黃嘌呤氧化酶、一氧化氮、超氧化物歧化酶及丙二醛等。通過(guò)離體心臟灌流進(jìn)行電生理研究,測(cè)定各組動(dòng)物心房間傳導(dǎo)時(shí)間,房室傳導(dǎo)周期,心房有效不應(yīng)期及房顫誘發(fā)率。通過(guò)馬松染色觀察心房間質(zhì)纖維化水平,通過(guò)HE染色觀察心房肌細(xì)胞排列情況。通過(guò)免疫組化觀察心房組織XO表達(dá)情況,通過(guò)western blot法檢測(cè)氧化應(yīng)激(XO,Mn-SOD),心肌纖維化及其上游相關(guān)蛋白(TGF-β,p-38,P-p38,JNK,P-JNK,ERK,P-ERK)、鈣通道調(diào)控蛋白(Cav_(1.2),RyR_2,SERCA_(2a),NCX,FKBP12.6,PLB,P-PLB)及線粒體代謝相關(guān)蛋白(TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1)表達(dá)情況。利用膜片鉗技術(shù)測(cè)定左心房心肌細(xì)胞L型鈣電流并利用共聚焦顯微鏡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變。為進(jìn)一步研究鈣信號(hào)通路上游的調(diào)控機(jī)制,通過(guò)免疫組化,western blot及PCR觀察心房組織CaMKII及p-CaMKII蛋白及mRNA表達(dá)情況。培養(yǎng)小鼠心房肌細(xì)胞系HL-1細(xì)胞,將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:對(duì)照組,血管緊張素II(AngII)刺激組,別嘌呤醇預(yù)處理(10μM)+AngII刺激組,別嘌呤醇預(yù)處理(100μM)+AngII刺激組。通過(guò)檢測(cè)HL-1細(xì)胞中ROS生成及MnSOD等蛋白表達(dá)測(cè)定各組HL-1細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,測(cè)定各組細(xì)胞CaMKII及p-CaMKII蛋白表達(dá)水平。結(jié)果超聲檢查及病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,糖尿病組動(dòng)物左心室肥厚及心房間質(zhì)纖維化程度增加,發(fā)生明顯心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)。在電生理研究中,糖尿病組動(dòng)物心房間傳導(dǎo)時(shí)間及房室傳導(dǎo)周期延長(zhǎng),房顫誘發(fā)率明顯升高,發(fā)生明顯心臟電重構(gòu)。糖尿病組兔血清氧化應(yīng)激指標(biāo),包括黃嘌呤氧化酶(XO)、一氧化氮(NO)及丙二醛(MDA)水平明顯升高。另外,通過(guò)western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激、纖維化相關(guān)蛋白,包括XO,Mn-SOD,NF-κB,TGF-β,P-p38,P-JNK,ERK,P-ERK及線粒體合成代謝相關(guān)蛋白,包括TFAM,NRF-1,Drp-1,mfn1在糖尿病心房組織中表達(dá)水平均明顯升高,應(yīng)用別嘌呤醇干預(yù)可抑制心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)及電重構(gòu),降低氧化應(yīng)激、纖維化蛋白及線粒體合成相關(guān)蛋白表達(dá)。此外,糖尿病動(dòng)物心房組織中鈣通道蛋白如Cav_(1.2),NCX表達(dá)增加,L型鈣電流密度及細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變幅度均增大,提示糖尿病動(dòng)物心房細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)控異常,應(yīng)用別嘌呤醇干預(yù)后可改善鈣離子通道重構(gòu)。免疫組化及western blot顯示糖尿病組動(dòng)物心房組織CaMKII及p-CaMKII表達(dá)增加,應(yīng)用別嘌呤醇干預(yù)后可降低其表達(dá)水平。另外,應(yīng)用AngII刺激HL-1細(xì)胞后ROS生成及MnSOD表達(dá)水平有所上調(diào),且CaMKII及p-CaMKII蛋白表達(dá)有一定程度升高,給別嘌呤醇干預(yù)后可在一定程度降低其水平。結(jié)論別嘌呤醇作為一種抗氧化劑,可通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性,減少體內(nèi)活性氧的生成,抑制CaMKII活性,從而改善糖尿病兔心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)及電重構(gòu),抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)控異常,并改善線粒體代謝異常。因此,別嘌呤醇有可能成為糖尿病相關(guān)房顫的一種上游治療方法。關(guān)于別嘌呤醇對(duì)房顫的治療作用尚需進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R541.75
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

每個(gè)指標(biāo)測(cè)量三次，其最終數(shù)值為三次測(cè)量結(jié)果的平均值。圖2.1 分別為三組動(dòng)物測(cè)量過(guò)程獲取的樣圖。圖 2.1 各組家兔超聲心動(dòng)圖圖像注：A:對(duì)照組；B：糖尿病組；C:別嘌呤醇組。2.1.3.2 大鼠心臟超聲檢查糖尿病大鼠模型建立并入組喂養(yǎng) 6 周后，模型建立周期完成，從每組大鼠中隨機(jī)選取 10 只用于心臟超聲學(xué)檢查。將大鼠放置于氣體麻醉箱中進(jìn)行氣體麻醉后，將大鼠仰臥位固定在氣體麻醉臺(tái)，胸前及四肢剃毛。以小動(dòng)物超聲儀涂抹偶聯(lián)劑，將探頭置于大鼠胸前不同位置進(jìn)行記錄測(cè)量。采集切面包括心尖四腔、左心室長(zhǎng)軸、心尖兩腔及心尖長(zhǎng)軸等。所有超聲測(cè)值均取 3 個(gè)心動(dòng)周期的平均值。超聲測(cè)量的指標(biāo)包括：二尖瓣環(huán)舒張?jiān)缙谶\(yùn)動(dòng)速度，二尖瓣環(huán)舒張晚期運(yùn)動(dòng)速度，舒張期室間隔厚度，收縮期室間隔厚度，左心房直徑，舒張期左心室內(nèi)徑，收縮期左心室內(nèi)徑，舒張期左室后壁厚度，收縮期左室后壁厚度，射血分?jǐn)?shù)，短軸縮短率等。

19注：*：與對(duì)照組相比，p<0.05；#：與 DM 組相比，p<0.05。圖 2.2 兔電生理不同位置心電圖及房顫誘發(fā)率注：A：不同部位電圖：高位右房，高位左房，低位左房及右室；B：給兔心房加以 burst 刺激后誘發(fā) AF；C：三組兔 AF 誘發(fā)率。2.2.2.2 大鼠電生理研究結(jié)果電生理研究顯示，三組動(dòng)物竇性周長(zhǎng)（SLC）、右心房有效不應(yīng)期（RAERP）、左心房有效不應(yīng)期（LAERP）、房間傳導(dǎo)時(shí)間（IACT）、右心房心室傳導(dǎo)時(shí)間（RAVCT）、左心房心室傳導(dǎo)時(shí)間（LAVCT）都沒(méi)有明顯差異。AF 誘發(fā)率在 DM 組明顯增加，ALLO 組與 DM 組相比有所下降，但未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)三組動(dòng)物心電圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，DM 組和 ALLO組心率（HR）明顯減慢，RR 間期延長(zhǎng)。其他心電圖指標(biāo)，包括 PR、P
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本文編號(hào)：2880257