第一部分Kallistatin抗動(dòng)脈粥樣硬化炎癥及機(jī)制研究目的:探討組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白(kallistatin,KS)抑制動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的作用及其可能的機(jī)制。方法:利用頸總動(dòng)脈分支結(jié)扎(PLCA)+高脂飲食的方法建立ApoE~(-/-)小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化模型。分別用腺病毒介導(dǎo)人KS cDNA(Ad.HKS)和空載腺病毒(Ad.Null)轉(zhuǎn)染小鼠,術(shù)后14天和28天經(jīng)核磁共振成像(MRI)檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展,利用免疫組化、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)斑塊內(nèi)炎癥巨噬細(xì)胞M1/M2分型。進(jìn)一步利用人KS蛋白(HKS)干預(yù)RAW264.7巨噬細(xì)胞,Real-time PCR檢測(cè)M1/M2分型;使用Krüppel樣因子4(KLF4)小干擾RNA(siRNA)阻斷其信號(hào)通路。Western blot、流式細(xì)胞分析檢測(cè)KLF4對(duì)HKS調(diào)節(jié)M1/M2分型的作用。結(jié)果:Ad.HKS轉(zhuǎn)染后小鼠體內(nèi)可高表達(dá)人KS蛋白。MRI及免疫組化顯示KS抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成且抑制炎癥細(xì)胞聚集。免疫熒光及PCR顯示M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物一氧化氮合酶(iNOS)和單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)表達(dá)下降,M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物精氨酸酶1(Arg1)和白細(xì)胞介素10(IL-10)表達(dá)升高。RAW264.7巨噬細(xì)胞的研究顯示,KLF4 siRNA可阻斷KS對(duì)M1/M2巨噬細(xì)胞分化調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:KS可通過KLF4調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞的分化,抑制炎癥反應(yīng)從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。第二部分黑色素納米顯像劑89Zr-RGD-MNP的構(gòu)建及對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的活體成像研究目的:設(shè)計(jì)合成一種以黑色素納米顆粒為載體,可靶向至動(dòng)脈粥樣硬化αⅴβ3的正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET)顯像劑89Zr-RGD-MNP,并應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化活體成像檢測(cè)其效果。方法:以超小型水溶性黑色素納米顆粒(MNP)為載體,共軛連接環(huán)狀c(RGDf C)蛋白,鰲合放射性核素89Zr制備靶向動(dòng)脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞受體αⅴβ3的黑色素顯像劑。通過透射電鏡(TEM)、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)其基本形態(tài)、結(jié)構(gòu)和平均水合粒徑,MTT法檢測(cè)其細(xì)胞毒性,Fontana-Masson銀染色檢測(cè)其對(duì)巨噬細(xì)胞的靶向性。動(dòng)脈分支結(jié)扎法建立動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型,尾靜脈注射顯像劑,不同時(shí)間點(diǎn)PET成像檢測(cè)其成像效果,成像后利用γ放射性檢測(cè)儀檢測(cè)顯像劑在各組織分布情況。結(jié)果:制備出黑色素納米探針89Zr-RGD-MNP。TEM檢測(cè)顯示其形態(tài)規(guī)則、DLS平均水合粒徑10 nm且分布均勻。MTT法顯示其對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響,Fotana-Masson銀染色顯示對(duì)巨噬細(xì)胞靶向性高。PET成像顯示顯像劑可在動(dòng)脈粥樣硬化部位高度聚集,并可被特異性阻斷劑阻斷。體內(nèi)放射性分布顯示動(dòng)脈粥樣硬化血管放射性(5.29%±0.78%)明顯高于空白對(duì)照血管(2.11%±1.55%)。結(jié)論:成功制備出性能穩(wěn)定,粒徑較小、分散性好、生物安全性高的黑色素顯像劑。能夠成功用于動(dòng)脈粥樣硬化的活體PET顯像,有望成為一種新型的檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化的顯像劑。
【學(xué)位單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R543.5
【部分圖文】：

圖 1.1 頸動(dòng)脈分支結(jié)扎建立動(dòng)脈粥樣硬化模型的方法。6）術(shù)后清理手術(shù)創(chuàng)面，縫合皮膚。待動(dòng)物蘇醒后置于 SPF 級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，20~25℃，燈光開閉各 12 h，繼續(xù)予高脂飲食。2.2 7.0 T 核磁共振成像采用德國 Bruker7.0TMicro-MR 成像系統(tǒng)，在小鼠術(shù)后 14d 及 28d 進(jìn)行核磁共振掃描。1）用 3-4%濃度異氟烷誘導(dǎo)麻醉小鼠，仰臥位放置于專用掃描床內(nèi)，異氟烷以 1-2% 濃度 0.3-0.5L/min 流量持續(xù)麻醉，呼吸監(jiān)測(cè)調(diào)整呼吸頻率在 40 次/分左右以確保像圖像質(zhì)量。2）MR 定位像掃描，使小鼠頸部置于磁場(chǎng)中心，為確保不同掃描時(shí)間點(diǎn) MR圖像可以匹配，掃描時(shí)以主動(dòng)脈弓為起點(diǎn)。采用 T2 及 PD 加權(quán)成像序列，具體參數(shù)如下：PD-T2：TR 1206.9 ms, TE 12.8/34.2 ms, FOV 2.5 × 2.5 cm, FA 180°,矩陣

圖 1.3 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè) 28 天時(shí) ApoA1mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。A. 血管組織，B. 肝臟組織。*P＜0.05,Ad. HKS vsAd. Null。3.3 HKS 抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展動(dòng)物分別在建模后14天、28天行MRI檢測(cè)。MRI采用德國Bruker 7.0 TMicro-MR成像系統(tǒng)，T2-PD雙回波序列。如圖1.4所示，正常對(duì)照側(cè)血管在T2WI上呈低信號(hào)，在PDWI上呈等信號(hào)，術(shù)側(cè)血管在T2WI和PDWI信號(hào)均增強(qiáng)。在14天時(shí)，可見動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，管腔狹窄；28天時(shí)，管腔狹窄可見明顯加重。Ad. HKS組管腔直徑（14天 0.44 ± 0.04 mm，28天 0.34 ± 0.07 mm）和斑塊體積（14天0.35 ±0.06 mm3，28天0.59 ±0.15 mm3）明顯小于Ad. Null組（血管直徑14天 0.44 ± 0.04 mm，28天 0.34 ± 0.07 mm 和斑塊體積 14天0.35 ±0.06mm3，28天0.59 ±0.15 mm3）。

52圖 1.4 Ad. Null 和 Ad. HKS 組術(shù)后 14 天及 28 天的頸部血管動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展情況的 MRI圖像。MSME-PD 為質(zhì)子加權(quán)像，MSME-T2 為 T2 加權(quán)像。A. 術(shù)后 14 天顯示，兩組圖像上均有左側(cè)（手術(shù)側(cè)）血管管腔 PD 及 T2 信號(hào)增高，管壁增厚，較對(duì)側(cè)狹窄，但 Ad. HKS 組管壁厚度明顯小于 Ad. Null 組。B. 術(shù)后 28 天顯示，兩組左側(cè)血管管壁厚度均增加， Ad.HKS 組管壁厚度仍然小于 Ad.Null 組。 C. 兩組左側(cè)血管管腔直徑的比較。D. 兩組斑塊體積的比較。mean 士 SD *P < 0.05,Ad. HKS vsAd. Null。3.4 HKS 抑制頸動(dòng)脈斑塊炎癥血管HE染色顯示管腔狹窄與MRI結(jié)果相符合。CD68染色顯示Ad. HKS組14天時(shí)CD68陽性細(xì)胞占5.88 ± 3.20%，28天時(shí)占16.89 ±9.12%；Ad. Null組14天時(shí)CD68陽性細(xì)胞占22.76 ±5.72%，28天時(shí)占32.30 ±8.11% (n = 10, P < 0.05，圖1.5)。結(jié)果表明Ad. HKS組的斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞明顯少于Ad. Nul組。肝臟CD68染色顯示Ad. HKS組14天時(shí)CD68陽性細(xì)胞占2.79 ±1.12%斑塊面積，28天時(shí)占4.32 ±1.32%；Ad. Null組14天時(shí)CD68陽性細(xì)胞占8.23 ±3.72%，28
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