背景:再灌注治療是目前治療急性心肌梗死的主要方法,但是再灌注損傷卻限制了患者的臨床獲益,增加了患者心衰的發(fā)生率。從再灌注損傷到進(jìn)展為心衰的不同階段,各種細(xì)胞(包括微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞)發(fā)揮著不同的作用。我們的前期研究證實(shí),再灌注損傷引起的微循環(huán)破壞是再灌注損傷發(fā)生的首要環(huán)節(jié),并且微循環(huán)的破壞會(huì)進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞的缺氧損傷,最終引起心肌細(xì)胞發(fā)生壞死、纖維化,導(dǎo)致心衰的發(fā)生。因此,為了改善患者預(yù)后,減少患者心衰的發(fā)生,必須要闡明不同階段的、不同細(xì)胞的損傷機(jī)制。線粒體是細(xì)胞能量代謝的核心,為生命活動(dòng)提供必須的能量,我們的研究已經(jīng)證實(shí),線粒體損傷以及細(xì)胞能量代謝的改變,在再灌注損傷以及心衰進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。但是引起線粒體損傷,調(diào)控線粒體代謝改變的上游信號(hào)目前并不清楚。因此,探究再灌注損傷中微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞以及心肌細(xì)胞在心肌的急慢性期損傷中線粒體的損傷機(jī)制,對(duì)于改善心肌梗死患者的預(yù)后具有十分重要的意義。目的:本研究的主要目的是通過線粒體損傷和線粒體能量代謝,探究再灌注損傷中微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞以及長期缺氧環(huán)境中線粒體損傷和線粒體能量代謝改變的機(jī)制,闡明微循環(huán)破壞以及心肌損傷的機(jī)制,以尋求有效的干預(yù)測策略,改善患者預(yù)后。方法:利用qPCR技術(shù)、熒光探針、western blot、病毒過表達(dá)、突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、干擾RNA敲低、免疫熒光共定位染色高效薄層色譜法等技術(shù),觀察蛋白轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、線粒體能量代謝、線粒體ROS生成、線粒體cyt-c滲出、心磷脂氧化、線粒體膜電位、mPTP開放、線粒體凋亡通路、線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性等變化,明確線粒體損傷和能量代謝改變在心臟急、慢性損傷中的作用及其上游的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:1.氧化應(yīng)激損傷通過誘導(dǎo)的IP3R依賴[Ca2+]c超載導(dǎo)致CMECs凋亡。2.IP3R依賴的[Ca2+]c超載通過激活VDAC介導(dǎo)的[Ca2+]m超載,導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能破壞。3.在H202作用下,褪黑素通過激活MAPK/ERK,發(fā)揮對(duì)CMECs的保護(hù)作用。4.缺氧損傷參與心肌細(xì)胞中miR-138的表達(dá)調(diào)節(jié)。5.miR-138可以抑制心肌細(xì)胞糖酵解并促進(jìn)線粒體呼吸。6.PDK1是miR-138的直接作用靶點(diǎn)。7.缺氧損傷通過增加糖酵解和減少線粒體呼吸,抑制心肌細(xì)胞活力。8.缺氧條件下,過表達(dá)miR-138可通過靶向作用PDK1,增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力。結(jié)論:1.鈣作為IP3R升高的傳遞信號(hào),通過VDAC廣泛滲透到線粒體中,導(dǎo)致線粒體鈣超載,導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的崩潰。2.褪黑素可刺激失活CREB的MAPK/ERK,下調(diào)IP3R/VDAC表達(dá),促進(jìn)[Ca2+]c/[Ca2+]m穩(wěn)態(tài),阻斷線粒體依賴的細(xì)胞死亡通路。3.長時(shí)間暴露于缺氧環(huán)境下,miR-138的表達(dá)受到顯著抑制,而過表達(dá)MiR-138可以保護(hù)人類心肌細(xì)胞免受缺氧影響。4.MiR-138通過直接靶向作用于PDK1,抑制糖酵解,促進(jìn)線粒體呼吸。5.缺氧通過增加糖酵解和減少線粒體呼吸引起心肌細(xì)胞死亡。6.慢性缺氧刺激下,通過糖酵解抑制劑或抑制PDK1抑制糖酵解,有助于心肌細(xì)胞存活。7.在miR-138過表達(dá)的心肌細(xì)胞中恢復(fù)PDK1的表達(dá)可提高細(xì)胞對(duì)缺氧的敏感性。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

圖１：原代ＣＭＥＣｓ的形態(tài)特點(diǎn)。Ａ：ＡＤＭＳＣｓ呈梭形和鵝卵石樣形態(tài)。Ｂ－Ｃ：免疫熒光結(jié)果顯??示，ＣＭＥＣｓ對(duì)ＣＤ３１呈單形陽性，能夠吸收ＤｉＬ－Ａｃ－ＬＤＬ。??３．２褪黑素對(duì)ＣＭＥＣｓ活性和增殖能力的影響??

黑素（１、２、５、１０?ｐｍ／Ｌ）對(duì)ＣＭＥＣｓ進(jìn)行處理和干預(yù)，然后分別在處理后的第１、２、??３、４、５、６、７天，我們使用ＣＣＫ－８試驗(yàn)來評(píng)估在褪黑素治療下ＣＭＥＣｓ的生長動(dòng)??力學(xué)。如圖２ｂ所示，隨著褪黑素濃度的增加，ＣＭＥＣｓ的生長能力逐漸增強(qiáng)。然??而，在前２４小時(shí)內(nèi)，兩組之間并無顯著差異。結(jié)果提示我們，褪黑素可以促進(jìn)??ＣＭＥＣｓ的増殖能力，濃度越高，增殖能力越強(qiáng)。??１５??

黑素干預(yù)后，ＣＭＥＣｓ的凋亡水平明顯減輕，并且隨著劑量的增加，這種抗凋亡??作用越強(qiáng)（褪黑素ｌｐｍ／Ｌ，６８．２６±５．４１％；?２ｐｍ／Ｌ，?５６＿３４±３＿２１％；?５ｐｍ／Ｌ，??２８．４２±５．１７％；?ｌ〇ｎｍ／Ｌ，１８．３３±４．３６％；圖３Ａ）。表明褪黑素可能會(huì)阻止過氧化氫??對(duì)ＣＭＥＣｓ的致命影響。此夕卜，我們通過ＬＤＨ釋放和ｃａｓｐａｓｅ３活性檢測來進(jìn)一步證??實(shí)褪黑素的抗凋亡作用。如圖所示，與空白對(duì)照組相比，Ｈ２０２組的ＬＤＨ釋放量??明顯增加，同時(shí)的ｃａｓｐａＳｅ３活性也明顯增加，在使用褪黑素千預(yù)后明顯的逆轉(zhuǎn)了??這些變化。通過ＬＤＨ釋放和ｃａｓｐａｓｅ３活性兩項(xiàng)平行實(shí)驗(yàn)（圖３Ｃ－Ｄ）進(jìn)一步證實(shí)了褪??黑素可以抑制Ｈ２０２引起的ＣＭＥＣｓ凋亡，促進(jìn)ＣＭＥＣｓ的存活。因?yàn)槭褂茫保埃纾恚??的褪黑素干預(yù)處理，抗凋亡作用最為明顯，因此，在以下的實(shí)驗(yàn)中，我們使用ｌ〇ｐｍ??／Ｌ的褪黑素來進(jìn)行干預(yù)。??＼?Ｈ２〇２?〇．３ｍＭ??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｍｅｌ?ＯｕＭ?Ｍｅｌ?ｌｕＭ?Ｍｅｌ?２ｎＭ?Ｍｅｌ?５ｆｉＭ?Ｍｅｌ?ＩＯｊｉＭ??■??Ｂ?Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ?ｏｆ
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本文編號(hào)：2875402