背景與目的風(fēng)濕性主動脈瓣狹窄是常見的導(dǎo)致左心室超負(fù)荷的疾病,是造成心力衰竭的主要病因之一;但是,通過人工瓣膜置換解除心室負(fù)荷并不能使所有患者同等受益�；颊咝g(shù)后心臟形態(tài)、功能的恢復(fù)情況與術(shù)前心功能情況呈正相關(guān)。我們在前期動物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),升主動脈縮窄50%的左室超負(fù)荷大鼠心臟功能會經(jīng)歷一段相對正常甚至輕度增加的代償期以及進(jìn)行性降低的失代償期,并在進(jìn)一步的去負(fù)荷手術(shù)中發(fā)現(xiàn)代償階段的左室超負(fù)荷大鼠心臟形態(tài)恢復(fù)佳,而失代償階段卻不能有效的恢復(fù)初始水平。雖然我們的前期研究很好的驗(yàn)證了臨床現(xiàn)象,但對于左室超負(fù)荷致心功能代償向失代償?shù)霓D(zhuǎn)變的具體機(jī)制尚未明確,有待進(jìn)一步研究。在超負(fù)荷所致機(jī)械應(yīng)力作用下產(chǎn)生包括:心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化、微血管結(jié)構(gòu)破壞、間質(zhì)膠原沉積等變化統(tǒng)稱為心肌重塑,是心肌結(jié)構(gòu)改變的主要病理學(xué)特征。在心肌組織中,約70%的細(xì)胞都是非心肌細(xì)胞,成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞是其中數(shù)量最多的細(xì)胞種類。我們推測心肌細(xì)胞除了自身的適應(yīng)性肥大之外,可能對間質(zhì)重塑的發(fā)生發(fā)展也起到重要的調(diào)控作用,而間質(zhì)重塑導(dǎo)致的基質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變可能是心臟功能從代償?shù)绞Т鷥斵D(zhuǎn)變的標(biāo)志。因此,研究超負(fù)荷過程中不同時期心肌重塑的變化特點(diǎn)及分子機(jī)制具有重要的意義。大量研究表明,Krüppel樣因子家族成員KLF15對間質(zhì)纖維化有重要的抑制作用,但具體機(jī)制不清楚。有研究表明,慢性主動脈瓣狹窄患者心肌組織TGF-β顯著增加,同時,受TGF-β調(diào)控的CTGF的表達(dá)也增強(qiáng)并證實(shí)了Smad3的磷酸化是TGF-β調(diào)控CTGF表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),推測可能與KLF15競爭性抑制磷酸化Smad3對CTGF轉(zhuǎn)錄啟動子的促進(jìn)作用。另一方面,有研究發(fā)現(xiàn):慢性壓力超負(fù)荷會導(dǎo)致p38-MAPK活化進(jìn)而抑制KLF15的表達(dá)。推測KLF15低表達(dá)可能是心肌細(xì)胞對間質(zhì)纖維化調(diào)控的關(guān)鍵因素。最新研究顯示:KLF15對心肌間質(zhì)血管生成中有著重要的作用,可能是KLF15抑制心功能失代償性轉(zhuǎn)變的另一關(guān)鍵途徑,其機(jī)制可能與KLF15正性調(diào)控VEGF的分泌有關(guān),有待進(jìn)一步研究�；谇捌谘芯考皣鴥�(nèi)外進(jìn)展,我們推測在超負(fù)荷疾病的病理生理發(fā)展過程中不同時期心肌重塑的變化各有特點(diǎn),而間質(zhì)性重塑是導(dǎo)致心功能衰竭的重要環(huán)節(jié)。KLF15作為關(guān)鍵性負(fù)性調(diào)控因子抑制間質(zhì)重塑從而抑制心功能衰竭。本研究引入KLF15過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠,并通過構(gòu)建左室壓力超負(fù)荷小鼠模型,對KLF15抑制左心室壓力超負(fù)荷所致心功能衰竭作用及機(jī)制進(jìn)行深入研究,有助于我們深入理解瓣膜疾病等壓力超負(fù)荷疾病的病理生理過程,并為改善慢性重癥瓣膜疾病的臨床轉(zhuǎn)歸提供理論依據(jù)。研究方法1.選用8-10周齡野生型(WT)健康雄性SPF級飼養(yǎng)C57/BL6J小鼠,在非人工通氣條件下行升主動脈縮窄術(shù)構(gòu)建左室壓力超負(fù)荷小鼠模型。分別于術(shù)前及術(shù)后1周、2周、3周、4周、5周、6周行心臟超聲檢查其射血分?jǐn)?shù)(EF)及短軸縮短率(FS),明確在不同時間點(diǎn)左室超負(fù)荷小鼠的心功能情況。在確定小鼠心功能代償期及失代償期的具體時間點(diǎn)后,進(jìn)一步采用M型心臟超聲及電子天平對其左室厚度、左室內(nèi)徑、心臟重量、肺重量等具體指標(biāo)進(jìn)行檢測,從大體形態(tài)上評價左室超負(fù)荷小鼠在不同階段心臟的形態(tài)學(xué)變化特點(diǎn)。2.在左室超負(fù)荷野生型小鼠心功能代償期及失代償期分別對其心肌組織行HE、Masson染色及血管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物CD31免疫組化染色;ELⅠSA檢測其心肌組織Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原含量;WB檢測心肌組織KLF15及其相關(guān)蛋白CTGF、VEGF的表達(dá)情況,p38、Smad3的磷酸化水平;并設(shè)置假手術(shù)組為空白對照。從心肌顯微結(jié)構(gòu)及分子表達(dá)層面進(jìn)一步闡明心功能代償期及失代償期的不同特點(diǎn),并對KLF15與其相關(guān)蛋白CTGF、VEGF表達(dá)水平及p38、Smad3磷酸化水平的內(nèi)在關(guān)系進(jìn)行更深入的研究。3.引入心臟過表達(dá)KLF15轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠為研究對象建立左室壓力超負(fù)荷模型,以野生型小鼠左室壓力超負(fù)荷模型為陰性對照,并分別設(shè)置假手術(shù)組作為空白對照。通過應(yīng)用超聲心動圖、心臟重量、肺重量、病理學(xué)及免疫組化染色、ELISA及WB等檢測方法從大體標(biāo)本、微觀結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)三個層面對KLF15如何調(diào)控相關(guān)因子的表達(dá)從而抑制左室超負(fù)荷所致心功能衰竭的具體機(jī)制進(jìn)行更深一步的探討研究結(jié)果1.超聲心動圖提示,在升主動脈縮窄術(shù)后2周時,與假手術(shù)組相比,超負(fù)荷組EF及FS均有一定程度的增加,且達(dá)到代償高峰,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2周之后超負(fù)荷組心功能隨縮窄時間延長呈下降趨勢,且在縮窄5周及6周與假手術(shù)組出現(xiàn)明顯差異(P0.05)。從心臟形態(tài)變化來看,心功能代償期小鼠心臟主要呈現(xiàn)出以IVS、LVPW增加為特征的向心性肥厚表現(xiàn),而心功能失代償期小鼠主要呈現(xiàn)以LVID增加為特征的離心性肥厚表現(xiàn)。心臟重量及肺重量的檢測結(jié)果表明,心功能代償期主要表現(xiàn)為心臟重量的增加,而在心功能失代償期心臟重量與肺重量均有增加且肺重量增加更為顯著。2.HE染色顯示:心功能代償期小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)肌纖維橫截面增粗、間距增加,細(xì)胞核深染等肥大表現(xiàn),心功能失代償期小鼠在肌纖維增粗的同時,其間距進(jìn)一步增加,且出現(xiàn)胞質(zhì)斷裂,碎片樣改變及肌纖維排列不規(guī)則等表現(xiàn)。Masson染色顯示:心功能失代償期小鼠心肌組織出現(xiàn)了嚴(yán)重的纖維化反應(yīng)。CD31免疫組化染色顯示心功能代償期小鼠心肌組織CD31密度增加,而心功能失代償期小鼠CD31密度明顯降低。ELISA顯示:心功能代償期小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05);心功能失代償期小鼠心�、�、Ⅲ型膠原蛋白含量與假手術(shù)組相比明顯增加(P0.01)。WB顯示:心功能代償期小鼠心肌僅表現(xiàn)出Smad3磷酸化水平的增加(P0.01),而心功能失代償期小鼠心肌KLF15及VEGF表達(dá)水平降低(P0.01)、CTGF表達(dá)水平及p38、Smad3磷酸化水平均明顯增加(P0.01)。3.在左室超負(fù)荷6周的條件下,超聲心動圖提示,與WT小鼠相比,TG小鼠LVID的增加及EF、FS的降低均有明顯減輕。肺重量增加相對輕微。病理學(xué)染色顯示野生型小鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的間質(zhì)纖維化反應(yīng)。CD31免疫組化染色顯示W(wǎng)T及TG小鼠心肌組織CD31密度均明顯降低,TG小鼠心肌組織CD31密度降低程度更為輕微。ELISA顯示:左室超負(fù)荷WT小鼠心�、瘛ⅱ笮湍z原蛋白含量與左室超負(fù)荷TG小鼠相比明顯增加(P0.01)。WB顯示:與左室超負(fù)荷WT小鼠相比,左室超負(fù)荷組TG小鼠CTGF表達(dá)水平明顯降低(P0.01);VEGF及KLF15表達(dá)水平均明顯增加(P0.01)。結(jié)論1.本研究采用的非人工通氣升主動脈縮窄術(shù)可成功構(gòu)建左室超負(fù)荷動物模型,且在應(yīng)用該建模方法后2周和6周兩個不同時相點(diǎn),分別可成功構(gòu)建出心功能代償模型及心功能失代償模型;2.在心功能代償期,心肌重塑的特點(diǎn)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大及間質(zhì)微血管密度一定程度的代償增加,無明顯間質(zhì)纖維化,心功能可維持正常甚至一定程度代償增加;其機(jī)制與KLF15抑制p-Smad3對CTGF轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用及對VEGF的正性調(diào)控有關(guān)。3.在心功能失代償期,除了心肌細(xì)胞本身的肥大之外,還出現(xiàn)了心肌間質(zhì)嚴(yán)重的纖維化、膠原蛋白沉積及間質(zhì)血管生成障礙等復(fù)雜的立體的重塑,并伴隨著心功能的降低。其機(jī)制與p38磷酸化抑制KLF15表達(dá),低表達(dá)的KLF15失去了對CTGF轉(zhuǎn)錄的抑制作用及VEGF轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用有關(guān)。4.心臟特異性KLF15過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠可明顯改善左室壓力超負(fù)荷6周所導(dǎo)致的心功能衰竭,其作用途徑與抑制間質(zhì)纖維化、膠原沉積及促進(jìn)血管生成作用有關(guān)。具體機(jī)制與KLF15過表達(dá)補(bǔ)償了上游磷酸化p38對其的抑制作用,并通過正性調(diào)控VEGF表達(dá)與負(fù)性調(diào)控CTGF表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R541.6
【部分圖文】：

圖 1-1 KLF15 及其相關(guān)分子通路示意圖a：左室壓力超負(fù)荷心功能代償期分子通路示意圖；b：左室壓力超負(fù)荷心功能失代償期分子通示意圖；c：過表達(dá) KLF15 改善左室壓力超負(fù)荷心功能失代償分子通路示意圖；

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文（2）我們構(gòu)建左室超負(fù)荷小鼠 10 只共耗費(fèi)野生型小鼠 17 只，建模死亡率為58.82%，其中，因氣胸導(dǎo)致死亡 4 只，因出血過多導(dǎo)致死亡 2 只，因急性左心功能衰竭死亡 1 只。我們隨機(jī)將這 10 只左室超負(fù)荷小鼠分為兩組，分別在術(shù)后 2 周及術(shù)后周對其進(jìn)行針對性研究。另外設(shè)立假手術(shù)組（Sham）10 只并隨機(jī)分為兩組，在對應(yīng)的時間點(diǎn)作為陰性對照。即：超負(fù)荷 2 周組（aortic banding 2 weeks, AB2W）、超負(fù)荷6 周組（aortic banding 6 weeks, AB6W）、假手術(shù) 2 周組（sham-operated 2 weekSham2W）、假手術(shù) 6 周組（sham-operated 6 weeks, Sham6W），共計四組。

6 周組（aortic banding 6 weeks, AB6W）、假手術(shù) 2 周組（sham-operated 2 weeks,Sham2W）、假手術(shù) 6 周組（sham-operated 6 weeks, Sham6W），共計四組。圖 2-1 C57 野生型小鼠非人工通氣下升主動脈縮窄術(shù)示意圖a：箭頭所指為升主動脈縮窄部位；b：顯微鏡目鏡下顯示成功縮窄的升主動脈；
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本文編號：2875331