研究背景:心血管疾病尤其是缺血性心臟病的治療取得了很大的改善,可是心衰作為各種心血管疾病的終末期表現(xiàn),是心血管疾病高致死率和高致殘率的主要原因。盡管心衰的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,但是現(xiàn)有的治療仍不能最大程度地控制心衰病程的進(jìn)展和死亡。近年來(lái)逐漸認(rèn)識(shí)到,心肌細(xì)胞代謝在充血性心衰發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前認(rèn)為,心肌能量代謝有望成為心衰的治療靶點(diǎn)。各種原因?qū)е碌男乃ゾ�粒體結(jié)構(gòu)和功能都受到破壞,線粒體功能障礙是心肌能量饑餓的根本原因,如何減少線粒體的破壞,改善線粒體的氧化磷酸化功能是心衰心肌能量代謝治療的關(guān)鍵。了解心衰過(guò)程中引起線粒體功能障礙的復(fù)雜機(jī)制可以為心衰的治療尋找新的靶點(diǎn)。PDE5(phosphodiesterase5)抑制劑是臨床上批準(zhǔn)用于治療肺動(dòng)脈高壓和男性性功能障礙的成熟藥物,近年來(lái),大量的臨床和實(shí)驗(yàn)室致力于研究PDE5抑制劑在心血管方面的保護(hù)作用,PDE5抑制劑可以對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷,可以抑制壓力超負(fù)荷心衰中心肌的重構(gòu),減少心梗后心肌細(xì)胞的凋亡,改善心功能。PDE5抑制劑的心血管保護(hù)作用通過(guò)增加細(xì)胞c GMP水平來(lái)實(shí)現(xiàn),而有報(bào)道稱c GMP依賴的信號(hào)通路可以調(diào)控脂肪細(xì)胞線粒體的生物發(fā)生和功能。然而,PDE5抑制劑對(duì)于心肌線粒體能量代謝的調(diào)控尤其是在心梗后心衰中的保護(hù)作用是否與改善線粒體功能有關(guān)以及其具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。研究目的:1.觀察PDE5抑制劑sildenafil能否改善心梗后心衰模型中線粒體結(jié)構(gòu)和功能破壞,進(jìn)而抑制心肌重構(gòu),改善心功能;2.探討sildenafil改善線粒體功能的機(jī)制,觀察Sirt3和PGC-1α在心梗后心衰中的表達(dá)變化以及sildenafil對(duì)其表達(dá)影響;3.明確sildenafil對(duì)離體心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù),探討Sirt3/PGC-1α信號(hào)通路在此過(guò)程中的作用。4.評(píng)價(jià)sildenafil介導(dǎo)的線粒體保護(hù)在心梗后心衰以及其它能量代謝障礙性疾病中的潛在作用。研究方法:1.選取8周齡的雄性C57BL/6小鼠,通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)方法建立心肌梗死(MI)模型,3天后利用超聲評(píng)估心臟功能判定模型建立成功;隨機(jī)分為兩組,分別用生理鹽水和PDE5抑制劑sildenafil腹腔注射4周,同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組(Sham組)術(shù)后4周檢測(cè)小鼠心臟功能變化;2.分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,采用缺氧去血清處理24小時(shí)模擬在體心肌缺血過(guò)程;3.采用培養(yǎng)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt3 sh RNA的方法,以降低心肌細(xì)胞Sirt3的表達(dá);4.MI模型建立4周以后取小鼠心臟,多聚甲醛固定后行馬松和天狼星紅染色檢測(cè)小鼠心肌纖維化程度;梗死周邊區(qū)心肌組織提取蛋白行Western blot檢測(cè)心肌纖維化標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)的變化;5.MI模型建立4周以后取梗死周邊區(qū)心肌組織,4%戊二醛固定后制成心肌超薄切片,通過(guò)投射電鏡來(lái)觀察心肌線粒體超微結(jié)構(gòu);6.MI模型建立4周以后取梗死周邊區(qū)心肌組織,提取新鮮線粒體,利用seahorse生物能量代謝測(cè)定儀檢測(cè)各組線粒體耗氧率(OCR)和呼吸控制率(RCR)的變化;7.提取心肌線粒體進(jìn)行JC-1染色或心肌組織冰凍切片行JC-1染色評(píng)估心肌組織線粒體膜電位(MMP)的變化,JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞MMP的變化;8.利用螢火蟲(chóng)熒光素酶和熒光素ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心肌組織和心肌細(xì)胞ATP的生成;9.運(yùn)用TUNEL法、Caspase 3活性測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)心肌組織及心肌細(xì)胞凋亡;10.運(yùn)用組織非放射性蛋白激酶G活性試劑盒檢測(cè)心肌組織PKG活性;11.運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)心肌組織及心肌細(xì)胞Sirt3 m RNA水平;12.運(yùn)用Western blot法檢測(cè)心肌組織及心肌細(xì)胞PDE5a,Sirt3,PGC-1α,乙�；腜GC-1α的表達(dá)和變化。研究結(jié)果:1.MI模型建立4周以后,小鼠心臟收縮功能包括左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)均顯著下降;心臟明顯擴(kuò)大,心肌纖維化程度顯著增加;心肌組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多,表明心肌細(xì)胞凋亡在心梗后心功能惡化和心肌重構(gòu)中起重要作用。Sildenafil治療組上述指標(biāo)均明顯改善,提示sildenafil可以減少心肌細(xì)胞凋亡,減輕心肌重構(gòu),改善心功能。2.MI模型建立4周以后,心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變,主要表現(xiàn)為線粒體排列紊亂,線粒體嵴斷裂,線粒體腫脹以及線粒體空泡化發(fā)生比例明顯增多;而線粒體功能指標(biāo)包括線粒體耗氧率和呼吸控制率均明顯下降,同時(shí)線粒體膜電位下降,ATP的生成明顯降低。同樣sildenafil處理組線粒體結(jié)構(gòu)破壞程度減輕,僅有少量的線粒體腫脹現(xiàn)象,無(wú)明顯線粒體空泡化發(fā)生。線粒體呼吸功能和線粒體膜電位均得到改善,提示sildenafil對(duì)心梗后心衰的心臟保護(hù)作用可能是通過(guò)改善線粒體結(jié)構(gòu)和功能實(shí)現(xiàn)的。3.心梗后心衰模型中,PGC-1α表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化,而PGC-1α的乙�；矫黠@升高,提示PGC-1α的活性降低;Sirt3的m RNA和蛋白表達(dá)也下降。Sildenafil治療可以明顯上調(diào)Sirt3的表達(dá),降低PGC-1α的乙�；�,恢復(fù)PGC-1α的活性。4.原代乳鼠心肌細(xì)胞缺氧去血清處理24h以后,心肌細(xì)胞的線粒體膜電位明顯下降,ATP生成減少,同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡增加;預(yù)先給予sildenafil處理后心肌細(xì)胞的膜電位破壞明顯減輕,ATP生成增多,同時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡減少。5.原代乳鼠心肌細(xì)胞缺氧去血清處理24h以后,Sirt3的表達(dá)明顯下降,PGC-1α的乙�；缴�,sildenafil預(yù)處理可以部分逆轉(zhuǎn)這一改變。6.原代乳鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt3 sh RNA質(zhì)粒下調(diào)Sirt3表達(dá)后,心肌細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性減弱,心肌細(xì)胞缺氧損傷加劇,表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡增多,線粒體膜電位破壞加劇,ATP生成量進(jìn)一步降低,同時(shí)sildenafil的保護(hù)作用部分削弱。研究結(jié)論:1.PDE5抑制劑sildenafil減少心梗后心衰模型中心肌細(xì)胞的凋亡,減輕心肌重構(gòu),改善心臟收縮功能。2.Sildenafil減輕心梗后心衰模型線粒體超微結(jié)構(gòu)和線粒體膜電位的破壞,改善線粒體的呼吸功能,從而提高ATP的生成。3.Sildenafil對(duì)心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響可能與Sirt3的表達(dá)上調(diào),PGC-1α的乙�；浇档�,PGC-1α的活性升高有關(guān)。4.Sildenafil減少離體心肌細(xì)胞缺氧損傷中細(xì)胞凋亡,減輕心肌線粒體膜電位破壞,增加ATP的生成。5.下調(diào)Sirt3表達(dá)增加心肌細(xì)胞缺氧損傷。6.Sildenafil的心肌細(xì)胞線粒體保護(hù)作用部分是通過(guò)調(diào)控Sirt3/PGC-1α信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。綜上所述,我們的研究證明,PDE5抑制劑sildenafil可以通過(guò)調(diào)控線粒體功能實(shí)現(xiàn)其對(duì)心梗后心衰心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,這一作用是通過(guò)調(diào)控Sirt3/PGC-1α的信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的,這一發(fā)現(xiàn)為心衰線粒體能量代謝治療提供新的靶點(diǎn)和干預(yù)手段,同時(shí)拓寬了sildenafil的臨床應(yīng)用,為其用于其他能量代謝障礙性疾病提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R541.6
【文章目錄】：
縮略語(yǔ)表
中文摘要
英文摘要
前言
文獻(xiàn)回顧
第一部分Sildenafil對(duì)心梗后心衰心功能和心肌重構(gòu)的影響
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
第二部分Sildenafil對(duì)心梗后心衰線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響及機(jī)制
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
第三部分Sirt3/PGC-1α 通路在SILDENAFIL對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷中的作用
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果
致謝


本文編號(hào)：2873564