發(fā)布時間：2020-11-06 09:24

　　 第一部分:實驗一:目的:下調(diào)人主動脈平滑肌細(xì)胞(HA-VSMCs)的Rho激酶Ⅰ/Ⅱ(ROCKⅠ/Ⅱ)基因表達(dá)。方法:首先利用siRNA技術(shù)分別下調(diào)HA-VSMCs的ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ基因,24h后倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果,細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后將細(xì)胞分成6組:空白對照組、ROCKⅠsiRNA 組、ROCKⅡsiRNA 組、TGF-β1 組、ROCKⅠsiRNA+TGF-β1 組、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β1 組,空白對照組、ROCK ⅠsiRNA 組、ROCK ⅡsiRNA 組在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),TGF-β 1 組、ROCK siRNA+TGF-β 1 組、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β 1組在含有5ng/mlTGF-β 1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),24h后Western blot檢測各組ROCK Ⅰ、ROCK Ⅱ蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:與空白對照組相比,TGF-β1組的ROCK Ⅰ蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05),而ROCK Ⅱ蛋白表達(dá)無明顯變化(P0.05);與空白對照組相比,ROCK ⅠsiRNA組、ROCK ⅡsiRNA組HA-VSMCs中相應(yīng)的靶蛋白ROCK Ⅰ、ROCKⅡ表達(dá)明顯降低(均 P0.0 5);與 TGF-β 1 組相比,ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 組、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β 1組HA-VSMCs中相應(yīng)的靶蛋白ROCK Ⅰ、ROCKⅡ表達(dá)明顯降低(均P0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建HA-VSMCs的ROCK ⅠsiRNA和ROCK ⅡsiRNA轉(zhuǎn)染模型。TGF-β 1可誘導(dǎo)HA-VSMCs的ROCK Ⅰ蛋白表達(dá),ROCK ⅠsiRNA轉(zhuǎn)染后可抑制此過程。實驗二:目的:探討ROCK Ⅰ/Ⅱ?qū)GF-β 1誘導(dǎo)的HA-VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響。方法:將體外培養(yǎng)的HA-VSMCs分成5組:空白對照組、TGF-β1組、ROCKⅠ siRNA +TGF-β 1 組、ROCKⅡ siRNA+TGF-β 1 組、Y-27632+TGF-β 1 組(Y-27632為ROCK Ⅰ的特異性抑制劑);分別進(jìn)行不同預(yù)處理,24h后Western blot及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別檢測各組細(xì)胞收縮型標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)、合成型標(biāo)志蛋白骨橋蛋白(OPN)的蛋白表達(dá)量和mRNA含量。結(jié)果:與 TGF-β 1 組相比,ROCK Ⅰ siRNA+TGF-β 1 組 α-SMA、SM22 α 的蛋白表達(dá)量和mRNA含量均顯著增加(P0.05),而OPN的蛋白表達(dá)量和mRNA含量均顯著減少(P0.05);與TGF-β1組相比,ROCKⅡ siRNA+TGF-β 1組上述蛋白表達(dá)量和mRNA含量均無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:TGF-β1可誘導(dǎo)HA-VSMCs由收縮型向合成型表型轉(zhuǎn)化,ROCKⅠ基因在這一轉(zhuǎn)化中起重要作用,而ROCKⅡ基因的作用不明顯。實驗三:目的:探討ROCK Ⅰ/Ⅱ?qū)GF-β 1誘導(dǎo)的HA-VSMCs遷移及增殖的影響。方法:將體外培養(yǎng)的HA-VSMCs分成5組:空白對照組、TGF-β 1組、ROCKⅠ siRNA+TGF-β 1 組、ROCKⅡsiRNA+TGF-β 1 組、Y-27632+TGF-β 1 組,分別進(jìn)行不同干預(yù)處理后,利用Transwell、CCK-8試驗檢測各組細(xì)胞遷移、增殖能力。結(jié)果:與空白對照組相比,TGF-β1組細(xì)胞遷移數(shù)明顯增加(P0.05);與TGF-β 1 組相比,ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 組、Y-27632+TGF-β 1 組細(xì)胞遷移數(shù)減少[(6 1.0 ± 1.8)vs.(208.3±18.9);(63.3 ± 7.4)vs.(208.3 ± 18.9),均P0.05],而ROCK ⅡsiRNA+ TGF-β 1組細(xì)胞遷移無明顯變化(P0.05)。與空白對照組相比,TGF-β1 組OD 值升高[(1.350±0.057)vs.(1.252±0.061),P0.05];與 TGF-β1 組比較,ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 組、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β 1組、Y-27632+TGF-β 1組OD值均無明顯變化(均P0.05)。結(jié)論:在TGF-β 1誘導(dǎo)的HA-VSMCs遷移中ROCK Ⅰ起重要作用,而在TGF-β 1誘導(dǎo)的HA-VSMCs增殖中ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ的作用均不明顯。第二部分:實驗一:目的:探究HA-VSMCs和人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HA-ECs)共培養(yǎng)對合成膠原蛋白Ⅰ型(COL Ⅰ)和膠原蛋白Ⅲ型(COL Ⅲ)的影響。方法:將體外培養(yǎng)的HA-VSMCs和HA-ECs利用Transwell小室建立VSMC-EC共培養(yǎng)模型,VSMC上室,EC下室,24h后將細(xì)胞分為:EC對照組、VSMC對照組、VSMC-EC 共培養(yǎng)組、EC+TGF-β 1 組、VSMC+TGF-β 1 組、VSMC-EC 共培養(yǎng)+TGF-β1組,培養(yǎng)6h、12h、24h以及48 h后利用ELISA檢測培養(yǎng)上清中COL Ⅰ和COL Ⅲ的含量。結(jié)果:與EC對照組、VSMC對照組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)下COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表達(dá)量顯著升高(P0.01),與EC+TGF-β 1組、VSMC+TGF-β 1組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β 1組COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表達(dá)量顯著升高(P0.01),與VSMC-EC共培養(yǎng)組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β 1組COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表達(dá)量顯著升高(P0.01)。結(jié)論:VSMC-EC共培養(yǎng)可顯著增加COL Ⅰ和COL Ⅲ的蛋白合成,而TGF-β 1對此過程有顯著促進(jìn)作用。實驗二:目的:探究TGF-β 1誘導(dǎo)下人主動脈VSMC-EC共培養(yǎng)對ROCKⅠ和RhoA蛋白合成的影響。方法:將體外培養(yǎng)的HA-VSMCs和HA-ECs分為:VSMC、VSMC+TGF-β 1組、VSMC-EC 共培養(yǎng)組、VSMC-EC 共培養(yǎng)+TGF-β 1 組,24h 后利用 Western blot 檢測ROCK Ⅰ和RhoA的蛋白表達(dá)量。結(jié)果:與VSMC對照組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)組ROCKⅠ和RhoA蛋白表達(dá)量無明顯差異(P0.05);與 VSMC+TGF-β 1 組相比,VSMC-EC 共培養(yǎng)+TGF-β 1 組 ROCKⅠ和RhoA蛋白表達(dá)量無明顯差異(P0.05);與VSMC組相比,VSMC+TGF-β1組ROCKⅠ蛋白表達(dá)量明顯增加(P0.05),而RhoA蛋白表達(dá)量無明顯差異(P0.05);與VSMC-EC共培養(yǎng)組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β 1組ROCKⅠ蛋白表達(dá)量顯著增加(P0.0 1),且RhoA蛋白表達(dá)量明顯增加(P0.05)。結(jié)論:在TGF-β 1作用下有遷移能力的HA-VSMCs與HA-ECs共同培養(yǎng)可促進(jìn)ROCK Ⅰ和RhoA的蛋白表達(dá)。實驗三:目的:探究下調(diào)HA-VSMCs的ROCK Ⅰ基因表達(dá)后與HA-ECs共培養(yǎng)對合成C01Ⅰ、COlⅢ、ROCKⅠ 和 RhoA 蛋白的影響。方法:將體外培養(yǎng)的HA-VSMCs通過siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)其ROCK Ⅰ基因,再將轉(zhuǎn)染后的HA-VSMCs和未轉(zhuǎn)染的HA-ECs分成5組:VSMC-EC共培養(yǎng)組、VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β 1 組、VSMC-EC 共培養(yǎng)+ROCKⅠsiRNA+TGF-β 1 組、VSMC-EC 共培養(yǎng)+siRNA-C+TGF-β 1 組、VSMC-EC 共培養(yǎng)+Y-27632+TGF-β 1 組,24h 后 ELISA 檢測不同分組COL Ⅰ和COLⅢ的含量,Western blot檢測不同分組ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表達(dá)量。結(jié)果:與VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β 1組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)+ROCKⅠsiRNA+TGF-β 1 組及 VSMC-EC 共培養(yǎng)+Y-27632 +TGF-β 1 組 COL Ⅰ 和 COLⅢ蛋白表達(dá)量顯著減少(P0.01);與VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β 1組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)+siRNA-C+TGF-β 1組COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表達(dá)量無明顯差異(P0.05),與VSMC-EC共培養(yǎng)組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β 1組COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表達(dá)量顯著增加(P0.01)。與VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β1組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)+ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 組、VSMC-EC 共培養(yǎng)+Y-27632+TGF-β 1 組 ROCK Ⅰ 和RhoA蛋白表達(dá)量無明顯差異(P0.05);與VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β1組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)+siRNA-C+TGF-β 1組ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表達(dá)量無明顯差異(P0.05);與VSMC-EC共培養(yǎng)組相比,VSMC-EC共培養(yǎng)+TGF-β 1組ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表達(dá)量顯著增加(P0.01)。結(jié)論:下調(diào)HA-VSMCs的ROCK Ⅰ基因可抑制TGF-β 1誘導(dǎo)的VSMC-EC共培養(yǎng)下COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白合成,而對TGF-β 1誘導(dǎo)的VSMC-EC共培養(yǎng)下ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表達(dá)含量無影響。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R543.1
【部分圖文】：

（所得數(shù)據(jù)均用Ｉ士ＳＤ表示，＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．空白對照組；＃Ｐ＜Ｏ．Ｏ５ｖｓ．ＴＧＦ－０１組）??圖１－２?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測ＲＯＣＫ?Ｉ蛋白的表達(dá)（柱狀圖與條帶圖分組對應(yīng)）??ｉｇｕｒｅｌ?－２?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＲＯＣＫ?Ｉ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ?（Ｇｒｏｕｐｓ?ｉｎ?ｔｈｅ??ｉｓｔｏｇｒａｍ?ａｎｄ?ｓｔｒｉｐｅ?ａｒｅ?ｔｈｅ?ｓａｍｅ）??（３）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測ＲＯＣＫ?ＩＩ蛋白的表達(dá)??如圖卜３?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ結(jié)果所示，與空白對照組比較，ＲＯＣＫ?ＩｓｉＲＮＡ組??ＯＣＫ?ＩＩ蛋白表達(dá)減少（Ｐ?＜０．０５），而ＴＧＦ－Ｐ１組ＲＯＣＫ?ＩＩ蛋白表達(dá)無明顯變??（Ｐ＞?０．?０５）；與?ＴＧＦ－Ｐ１?組比較，ＲＯＣＫ?ＩｓｉＲＮＡ＋ＴＧＦ－Ｐｌ?組?ＲＯＣＫ?ＩＩ?蛋白表??無明顯變化（Ｐ＞〇．〇５）?，?ＲＯＣＫ?ＩＩｓｉＲＮＡ＋?ＴＧＦ－Ｐ１組ＲＯＣＫ?ＩＩ蛋白表達(dá)減少??（Ｐ〈０．?０５）。??

（所得數(shù)據(jù)均用ｘ土ＳＤ表示，＊Ｐ＜０．?０５?ｖｓ．空白對照組；＃Ｐ〈０．?０５?ｖｓ．ＴＧＦ?｜３ｌ組）??圖３－１細(xì)胞遷移實驗Ａ：結(jié)晶紫染色法觀察（Ｘ１００）?；?Ｂ：各組遷移細(xì)胞數(shù)比較??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｃｅｌｌ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?ａｓｓａｙ?Ａ：?Ｃｒｙｓｔａｌ?ｖｉｏｌｅｔ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?（ｘｌＯＯ）；?Ｂ：??Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?ｍｉｇｒａｔｉｎｇ?ｃｅｌｌｓ?ａｍｏｎｇ?ｇｒｏｕｐｓ??２５??

鞫?銎交?∠赴?ㄒ�、怎V騁約氨硇妥??械淖饔茫崳?（２）?ＲＯＣＫ?Ｉ和ＲＯＣＫ?ＩＩ對ＴＧＦ－Ｍ誘導(dǎo)的ＨＡ－ＶＳＭＣｓ增殖的影響??如圖３－２結(jié)果所示，與空白對照組相比，ＴＧＦ－Ｐ１組０Ｄ值升高［（１．３５０土??０．?０５７）?ｖｓ．?（１．?２５２±０＿?０６１），Ｐ＜０．?０５］；與?ＴＧＦ－?Ｐ?１?組比較，ＲＯＣＫ?ＩｓｉＲＮＡ＋ＴＧＦ－??０?１?組、ＲＯＣＫ?ＩＩｓｉＲＮＡ＋?ＴＧＦ－?Ｐ?１?組、Ｙ－２７６３２＋ＴＧＦ－０?１?組?０Ｄ?值均無統(tǒng)計學(xué)差異??（均?Ｐ＞０．０５）。??１．６００??１．４００??，１１１１１??＃??，／，??（所得數(shù)據(jù)均用５土ＳＤ表示，＊Ｐ＜０．０５?ｖｓ．空白對照組）??圖３－２各組對ＨＡ－ＶＳＭＣｓ增殖情況比較??Ｆｉｇｕｒｅ３－２?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ａｍｏｎｇ?ｅａｃｈ?ｇｒｏｕｐ?ｏｆ?ＨＡ－ＶＳＭＣｓ??討論??近年來，隨著生活水平的提高，ＴＡＤ的發(fā)生率呈逐年增加的趨勢。目前，??有關(guān)ＴＡＤ的回顧性研究分析證實，胸主動脈腔內(nèi)修復(fù)術(shù)（ｔｈｏｒａｃｉｃ?ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ??ａｏｒｔｉｃ?ｒｅｐａｉｒ，ＴＥＶＡＲ）是治療ＴＡＤ的首選治療方案［４乂?ＴＡＤ常表現(xiàn)為突然地??劇烈撕裂樣或剝脫樣疼痛
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2872960