目的通過研究再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)小鼠模型自然殺傷細胞(nature killer cell,NK)數(shù)量、功能,明確NK細胞在AA發(fā)病機制中的作用及地位,同時通過分析不同免疫抑制及促造血治療方案對AA小鼠模型NK細胞及其下游免疫環(huán)節(jié)的影響,為AA開展新治療提供理論依據(jù)。進一步通過篩選重型再生障礙性貧血(Severe aplastic anemia,SAA)患者NK細胞的差異蛋白表達,探討NK細胞在AA中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制。方法第一部分:構(gòu)建AA小鼠模型,造模第17天收獲小鼠,測血常規(guī),分離右側(cè)股骨做骨髓病理;采用流式細胞術(shù)(FCM)、PCR、ELISA等方法檢測小鼠外周血NK細胞數(shù)量、亞群、功能,髓系樹突狀細胞(myeloid dendritic cell,mDC)數(shù)量及表面協(xié)同分子表達,CD8~+T細胞數(shù)量、功能,調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)數(shù)量及功能,血漿IFN-γ、IL-4水平。提取同源正常小鼠NK細胞回輸至AA小鼠體內(nèi),觀察小鼠癥狀、體征及免疫指標的變化。第二部分:構(gòu)建AA小鼠模型,分別給予環(huán)孢菌素A(CsA)、艾曲波帕(Elt)、CsA聯(lián)合Elt、雷帕霉素(RPM)進行藥物干預,觀察小鼠體重、血象、骨髓細胞計數(shù)、骨髓病理、生存期變化,采用FCM等方法檢測小鼠NK細胞數(shù)量、亞群、功能變化,mDC數(shù)量及表面協(xié)同分子表達變化,CD8~+T細胞數(shù)量、功能變化,Tregs數(shù)量及功能變化,血漿IFN-γ、IL-4水平變化。第三部分:分選SAA患者及正常對照外周血NK細胞,提取總蛋白,分為SAA組、正常組,標記肽段,進行質(zhì)譜檢測,每組重復兩次。采用PD軟件(Proteome Discoverer 1.4)篩選,SEQUEST HT搜素,搜索結(jié)果與篩選后的譜圖進行定量分析。ANOVA方差分析評估結(jié)果差異性,選取p0.05,ratio≥1.2或ratio≤0.83的蛋白為差異蛋白。結(jié)果第一部分:成功構(gòu)建AA小鼠模型,AA組小鼠體重、血象、骨髓細胞計數(shù)均明顯低于正常組(NC組)。應用FCM、PCR、ELISA檢測AA小鼠及正常小鼠細胞免疫狀態(tài)。結(jié)果顯示,AA組與NC組相比,CD8~+T細胞比例(52.23±6.45%vs 37.67±7.95%)、穿孔素(perforin)mRNA相對表達水平(1.78±0.15 vs1.15±0.22)、顆粒酶(GB)mRNA相對表達水平(1.81±0.16 vs 1.08±0.15)、mDC表面CD86表達水平(9.15±2.85%vs 6.18±2.10%)、CD80表達水平(18.09±3.39%vs 14.62±3.61%)均明顯升高,Tregs比例(4.80±2.07%vs 6.70±2.43%)、Tregs表面CTLA-4表達水平(15.13±4.80%vs 19.26±4.66%)均明顯下降,差別均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。AA小鼠NK細胞比例(0.59±0.37%vs 3.38±0.49%)、調(diào)節(jié)性NK細胞比例(2.79±2.54%vs 24.57±4.56%)較NC組明顯下降,功能性NK細胞比例(77.93±11.45%vs 49.92±6.48%)、調(diào)節(jié)性NK細胞表面NKG2D表達水平(87.14±6.26%vs 76.89±10.02%)、功能性NK細胞表面NKG2D表達水平(77.50±11.10%vs 67.03±8.22%)均較NC組明顯上升,差別均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。AA小鼠NK數(shù)量減少、調(diào)節(jié)性NK細胞比例降低與疾病嚴重程度存在一定相關(guān)性。NK細胞回輸后,NK細胞回輸組(NK組)小鼠NK細胞比例(12.61±3.10%vs 0.89±0.54%)、調(diào)節(jié)性NK細胞比例(26.14±4.98%vs1.66±1.68%)明顯高于AA組,差別均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。NK組小鼠Hb(83.50±7.88g/L vs 71.50±7.96 g/L)、RBC(5.17±0.97×10~(12)/L vs 4.08±0.83×10~(12)/L)、PLT(128.50±40.72×10~9/L vs 76.00±30.59×10~9/L)、骨髓細胞計數(shù)(6.92±1.10×10~7/L×10~7/L vs 3.92±0.89)、生存期(52.5天vs 25天)較AA組明顯上升,差別均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。NK組較AA組小鼠CD8~+T細胞、CD8~+T細胞內(nèi)perforin表達、CD8~+T細胞內(nèi)GB表達、mDC數(shù)量、mDC表面CD80與CD86的表達均下降,差別有統(tǒng)計學意義(p0.05),而Tregs數(shù)量及其CTLA-4表達水平無明顯變化(p0.05)。第二部分:AA小鼠體重、血象、骨髓細胞計數(shù)均明顯低于NC組,細胞免疫狀態(tài)明顯高于NC組。與AA組小鼠比較,(1)CsA治療組血象(Hb:89.40±11.61g/L vs 76.30±11.00 g/L;RBC:3.61±0.62×10~(12)/L vs 2.94±0.57×10~(12)/L;PLT:232.10±65.22×10~9/L vs 91.30±38.52×10~9/L)及骨髓衰竭狀態(tài)(3.67±0.62×10~7/L vs 2.44±0.77×10~7/L)改善,小鼠90天生存率提高(40%),CD8~+T數(shù)量減少(49.05±7.47%vs 68.12±5.81%),胞內(nèi)perforin(7.88±2.46%vs 10.53±2.06%)及GB(51.14±8.86%vs 68.71±7.96%)表達下降,mDC表面CD80(15.11±2.85%vs18.54±2.73%)表達下降,Tregs細胞表面CTLA-4(15.34±3.97%vs 12.63±2.68%)表達升高,調(diào)節(jié)性NK比例上升(12.14±3.44%vs 3.25±1.91%),差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(2)Elt組小鼠Hb(82.60±10.25 g/L)及RBC(3.62±0.44×10~(12)/L)升高,但骨髓細胞計數(shù)、生存期及細胞免疫狀態(tài)較AA小鼠均無明顯改善。(3)CsA+Elt組小鼠Hb(99.50±9.13g/L)、RBC(4.11±0.59×10~(12)/L)、PLT(243.70±56.35×10~9/L)、骨髓細胞計數(shù)(4.12±0.76×10~7/L)均明顯升高,90天生存率提高(80%),調(diào)節(jié)性NK細胞數(shù)量增加(11.20±3.41%),CD8+T細胞及mDC明顯受抑,Tregs數(shù)量(6.13±1.72%)及表面CTLA-4表達(16.47±2.59%)均升高(p0.05)。(4)RPM組小鼠治療后血象(RBC:3.81±0.24×10~(12)/L,Hb:93.70±10.45 g/L,PLT:255.50±53.10×10~9/L)、骨髓細胞計數(shù)(3.85±0.76×10~7/L)、90天生存率(80%)明顯上升(p0.05);功能性NK細胞表面NKG2D表達(68.70±5.50%)下降;其CD8~+T細胞數(shù)量(50.83±8.28%)、Perforin(6.35±2.49%)及GB(45.92±8.54%)表達均下降(p0.05);而Tregs數(shù)量(6.84±1.83%)及表面CTLA-4表達水平(17.48±2.43%)明顯升高(p0.05)。第三部分:與正常對照相比,SAA患者NK細胞93組蛋白表達水平存在明顯差異,其中上調(diào)蛋白48組,包括組蛋白H1.2、組蛋白H1.3、干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)等;下調(diào)蛋白45組,包括肌動蛋白相關(guān)復合體(ARP2/3),組蛋白H3、組蛋白H4、Protein S100 A8、Protein S100 A9等。結(jié)論(1)與對照組小鼠相比,AA小鼠模型中NK細胞數(shù)量減少,調(diào)節(jié)性NK細胞比例降低,NK細胞表面NKG2D表達升高。NK細胞回輸后,AA小鼠NK細胞缺乏的狀態(tài)改善,調(diào)節(jié)性NK細胞比例恢復,細胞免疫的亢進狀態(tài)受到抑制,改善了AA小鼠病情。提示NK細胞可能在AA發(fā)病中發(fā)揮保護性作用。(2)CsA、艾曲波帕、雷帕霉素均可改善AA小鼠模型造血功能,對AA小鼠模型治療有效。CsA聯(lián)合艾曲波帕治療效果最佳,提示二者可能存在協(xié)同作用。CsA可以明顯升高AA小鼠NK細胞數(shù)量及調(diào)節(jié)性NK細胞比例,對NK細胞功能存在明顯影響。雷帕霉素對AA小鼠Tregs有明顯擴增作用,并可以改善其功能。CsA、雷帕霉素均可抑制AA小鼠亢進的細胞免疫狀態(tài),從而改善小鼠病情,但作用機制可能存在差異。(3)通過蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn),SAA患者NK細胞在細胞組分、生物學過程、分子功能方面與正常對照組均存在明顯差異。SAA患者NK細胞的胞吞作用、FC-γ受體介導的吞噬作用相關(guān)蛋白明顯下調(diào)。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R556.5
【部分圖文】：

圖 1.1 小鼠 CD8+T 細胞分選純度圖，分選后 CD8+T 細胞比例為 95%以上A:：設(shè)門圖；B：分選后剩余細胞；C：分選得到的 CD8+T 細胞（3）提取總 RNA①取分選后的細胞至離心管中，加入 1 mLTrizol ，吹打混勻，室溫下放置15 分鐘。②加入氯仿 200μ1，劇烈震蕩混勻至粉色乳糜狀，室溫靜置 2-3min，4°C 離心， 12000rpm，15min。③自離心管內(nèi)輕吸出水相上層，轉(zhuǎn)移至新 EP 管中，不可接觸下層蛋白質(zhì)層。隨后加入預冷至 4°C 的異丙醇 600ul，震蕩混勻。在-20°C 環(huán)境中靜置 2 小時或過夜后， 4°C 離心，12000rpm，15min，棄去上清。④向下層沉淀中加入預冷的-20°C 無水 1ml，輕彈混勻， 4°C 離心，12000rpm，5min，棄上清，重復 1 次。⑤通風干燥處靜置 10min，使乙醇充分揮發(fā)，干燥 RNA。⑦加 RNase-free ddH2O 12μl，充分溶解 RNA，分光光度計測定 RNA 純度。

用中位數(shù)表示，采用秩和檢驗；構(gòu)成earman’s rank correlation test 分析；繪制 on 法比較小鼠生存曲線是否有差異；p<0一般情況、血象、骨髓計數(shù)分為正常對照組（NC 組），單純照射組較三組小鼠一般情況、血常規(guī)、骨髓計數(shù)情況 組小鼠造模第 17 天時體重為（22.00±1重為（21.18±1.83）g，AA 組小鼠造模三組之間差異有顯著性（p<0.01）。AA 組異有統(tǒng)計學意義（p<0.05），NC 組與 TB.2）。

×109/L；AA 組小鼠造模第 17 天時 WBC 為（9）×1012/L， Hb 為（69.00±14.34）g/L， PLOVA 方差分析，三組小鼠 WBC、RBC、Hb1）。分別兩兩比較顯示，TBI 組與 NC 組相有統(tǒng)計學意義（p<0.05），RBC 及 Hb 水平無明RBC、Hb、PLT 較 NC 組及 TBI 組均明顯（表 1.1，圖 1.3）。I 組、AA 組小鼠造模第 17 天血常規(guī)檢測數(shù)BC（×109/L） RBC（×1012/L） Hb（g/L）4.69±0.76 9.07±1.25 153.80±6.492.74±0.74*8.05±0.75 144.40±8.94.55±0.36*#4.18±1.39*#69.00±14.34*組比較差異有顯著性（p<0.05）；#表示和 T
【參考文獻】

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本文編號：2872504