研究背景和目的:紅細(xì)胞生成指造血干細(xì)胞在造血微環(huán)境中,通過細(xì)胞的自我更新、增殖、定向分化和脫核等重要的生物學(xué)事件,最終產(chǎn)生成熟紅細(xì)胞的過程。由于紅細(xì)胞生成紊亂或無效造血而引起的貧血是多種人類血液病重要的臨床表現(xiàn),其中包括骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndromes,MDSs)。MDSs是造血干祖細(xì)胞克隆發(fā)生異常的髓系疾病,主要特征是骨髓造血功能缺陷和髓內(nèi)細(xì)胞凋亡。而MDSs患者突變頻率最高的的基因是DNA雙加氧酶2(Ten-Eleven-Translocation 2,TET2),其功能是把5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcyosine,5-hmC),從而參與DNA去甲基化過程,影響靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。目前,關(guān)于TET2突變MDSs患者的紅系異常的分子機(jī)制仍不清楚。本課題組已報道,TET2敲低引起c-Kit和AXL介導(dǎo)的紅系祖細(xì)胞的克隆性增殖,從而出現(xiàn)功能異常Marker-CFU-E(M-CFU-E)細(xì)胞。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)M-CFU-E細(xì)胞不僅異常增殖,也發(fā)生大量的凋亡。因此,本研究主要是在體外紅系培養(yǎng)發(fā)育體系以及血液腫瘤細(xì)胞系中敲低TET2的表達(dá),以期揭示TET2調(diào)控紅系祖細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,為TET2突變的MDSs疾病相關(guān)的凋亡機(jī)制提供新的視角,也為治療MDSs疾病提供新的科學(xué)依據(jù)。研究方法:首先,我們選用CD34~+磁珠在臍帶血的單個核細(xì)胞中分離純度為95%以上的造血干細(xì)胞CD34~+,轉(zhuǎn)染攜帶TET2-shRNA的慢病毒,采用嘌呤霉素(Puromycin)進(jìn)行篩選,利用qRT-PCR方法,檢測TET2敲低效率并成功獲得TET2敲低細(xì)胞。在體外紅系培養(yǎng)體系中,運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)分選出正常組和TET2敲低組紅系祖細(xì)胞之后,通過流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測兩組細(xì)胞分化和凋亡,通過甩片觀察其形態(tài)。其次,為明確其相關(guān)凋亡分子,我們分選出Luciferase CFU-E和M-CFU-E兩組細(xì)胞,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq),運(yùn)用生物信息分析的方法,明確TET2敲低后的差異基因和凋亡相關(guān)信號通路;為了驗證其表達(dá)差異,運(yùn)用qRT-PCR和流式細(xì)胞技術(shù)同時檢測了TET2敲低型細(xì)胞中凋亡相關(guān)分子(FAS,Fas Cell Surface Death Receptor)的表達(dá)。為進(jìn)一步探討TET2敲低引起FAS上調(diào)的分子機(jī)制,我們通過糖基化和限制性內(nèi)切酶的處理方式,檢測并分析FAS啟動子區(qū)關(guān)鍵CCGG位點(diǎn)的5-mC和5-hmC的差異性。同時,選用FAS的下游通路中Caspase 3特異性抑制劑(Z-DEVD-FMK)進(jìn)一步驗證其凋亡通路。不僅如此,我們還分選出健康人與TET2突變的MDSs患者骨髓中的造血干細(xì)胞,在體外向紅系定向分化,檢測TET2突變對細(xì)胞凋亡和FAS表達(dá)的影響。最后,由于TET2突變參與了多種血液腫瘤的發(fā)生,因此,我們在紅白血病細(xì)胞系K562中敲低TET2的表達(dá),檢測TET2表達(dá)下降對K562細(xì)胞增殖及凋亡的影響。同時,在K562細(xì)胞中過表達(dá)FAS,檢測其對增殖和凋亡的影響。研究結(jié)果:為了探究TET2在紅系祖細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮的功能,我們首先驗證了感染TET2-shRNA的CD34~+細(xì)胞的敲低效率,結(jié)果顯示,實驗組TET2的表達(dá)水平大約是對照組TET2的表達(dá)水平的40%。在有效敲低TET2的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分選出TET2-CFU-E,且在體外紅系發(fā)育培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng),我們發(fā)現(xiàn)TET2有效敲低后,其分化受阻。為了探究分化受阻的細(xì)胞相關(guān)的表型,分選出功能異常的細(xì)胞(M-CFU-E),繼續(xù)用紅系培養(yǎng)體系培養(yǎng),我們發(fā)現(xiàn)其凋亡顯著增加。其次,為明確其相關(guān)凋亡分子,通過RNA-seq測序分析,結(jié)果顯示Luciferase CFU-E和M-CFU-E之間有多達(dá)400個差異基因,含25個與凋亡相關(guān)信號通路相關(guān)的基因,其中16個表達(dá)上調(diào),有FAS、NCKAP1和TNFRSF10B等,其表達(dá)顯著上調(diào)。通過qRT-PCR和流式檢測進(jìn)一步驗證FAS的表達(dá),結(jié)果顯示與Luciferase CFU-E相比,TET2-CFU-E細(xì)胞FAS表達(dá)不變,而M-CFU-E細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。為了探討TET2敲低引起FAS上調(diào)的機(jī)制,我們檢測將上述三組細(xì)胞進(jìn)行FAS啟動子區(qū)關(guān)鍵CCGG位點(diǎn)(-305,-251,-136,-90)5-mC和5-hmC檢測,結(jié)果顯示,與Luciferase CFU-E相比,TET2-CFU-E和M-CFU-E細(xì)胞中FAS關(guān)鍵CCGG位點(diǎn)的5-mC和5-hmC并沒有發(fā)生改變,因此FAS的表達(dá)可能不直接受TET2調(diào)控,TET2和FAS之間還存在其他的靶基因來相互調(diào)控基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步探究TET2缺失是否通過調(diào)控FAS下游信號分子Caspase 3引起凋亡,因此,我們選用TET2敲低后分選出的M-CFU-E進(jìn)行挽救實驗,結(jié)果顯示,與Luciferase CFU-E相比,Caspase 3特異性抑制劑(Z-DEVD-FMK)不能回復(fù)M-CFU-E細(xì)胞的凋亡,這表明TET2敲低后紅系早期祖細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡并不依賴于Caspase 3凋亡的通路。與此同時,我們發(fā)現(xiàn)與健康人相比,TET2突變的MDSs患者骨髓細(xì)胞的造血干細(xì)胞在紅系發(fā)育分化的第11天和13天其凋亡顯著增加,同時,FAS的表達(dá)在從11天到17天均上調(diào)。最后,由于高風(fēng)險性向白血病轉(zhuǎn)化是MDSs疾病的重要特征,而細(xì)胞凋亡在MDSs的發(fā)生和演變的過程中扮演重要角色。為了探討TET2調(diào)控的細(xì)胞凋亡在MDSs的演變中的功能,我們首先比較健康人骨髓細(xì)胞與血液腫瘤細(xì)胞K562中的TET2和FAS的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,TET2在K562細(xì)胞中的表達(dá)為健康人骨髓細(xì)胞的一半,并且FAS在K562細(xì)胞中不表達(dá)。為進(jìn)一步明確TET2在K562細(xì)胞中的功能,我們首先得到TET2敲低的K562細(xì)胞,隨后利用Hemin誘導(dǎo)其向紅系分化,結(jié)果顯示,與對照組相比,TET2敲低促進(jìn)細(xì)胞增殖,但不影響細(xì)胞凋亡,同時FAS的表達(dá)也沒有改變。進(jìn)一步在K562細(xì)胞中過表達(dá)FAS,結(jié)果顯示,高水平的FAS能夠促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡從而抑制其增殖。這表明,FAS的表達(dá)水平可能是TET2突變的MDSs疾病是否發(fā)生演變的重要調(diào)控分子,FAS及其下游信號通路可能作為潛在的藥物靶點(diǎn)治療血液腫瘤。結(jié)論:綜上所述,本論文探究了TET2在紅系祖細(xì)胞階段的重要功能:TET2敲低產(chǎn)生功能異常的M-CFU-E,其分化受阻、凋亡增加以及死亡受體FAS表達(dá)上調(diào)。TET2敲低不引起FAS啟動子區(qū)關(guān)鍵位點(diǎn)甲基化和去甲基化的改變,因此,TET2可能間接調(diào)控FAS的表達(dá)。TET2敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不依賴Caspase 3通路。與此同時,TET2突變的MDSs患者的骨髓細(xì)胞也伴隨大量凋亡,并且FAS的表達(dá)顯著上調(diào)。不僅如此,TET2敲低還能促進(jìn)血液腫瘤細(xì)胞系K562增殖,但不影響其凋亡。而過表達(dá)FAS卻能促進(jìn)K562細(xì)胞的大量凋亡。因此,FAS的表達(dá)水平可能作為TET2突變導(dǎo)致的MDSs疾病能否轉(zhuǎn)變?yōu)榘籽〉闹匾獦?biāo)志。通過本論文的研究,為TET2突變的MDSs疾病相關(guān)的凋亡機(jī)制提供新的視角,也為治療MDSs疾病提供新的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R551.3
【部分圖文】：

第一章 引言是 HPCs 中重要的一個分支，具有向巨核系和紅系雙向分化的特性[17]，存在促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）和干細(xì)胞因子（Stem cell factor，SCF）條件下，MEPs 能分化形成紅系祖細(xì)胞階段（BFU-E 至 CFU-E）[9]，繼而進(jìn)入終末紅系分化階段（Pro-E 至 Ortho-E），最終形成功能成熟紅細(xì)胞。對正常的人機(jī)體來說，紅細(xì)胞必不可少。由于紅細(xì)胞特殊的結(jié)構(gòu)，不但可以維持紅細(xì)胞特殊的雙面凹陷圓盤形狀，使其能夠最大限度地攝取 O2，而且也增加了紅細(xì)胞膜的柔韌度和變形能力，這也為細(xì)胞的穿梭和更好的輸送 O2提供便利及條件。此外，紅細(xì)胞中特有一種血紅蛋白，能和肺部與 O2結(jié)合形成氧合血紅蛋白，這蛋白是紅細(xì)胞載 O2的基礎(chǔ)。此外，在整個發(fā)育的過程中，細(xì)胞表面的標(biāo)記分子也發(fā)生了相應(yīng)的變化，進(jìn)一步來區(qū)分各個階段的細(xì)胞，為后續(xù)分選出各階段細(xì)胞提供依據(jù)（圖 1.1）[18]。

圖 1.2 TET 蛋白家族的結(jié)構(gòu)圖和 DNA 去甲基化的循環(huán)過程。（A）TET 蛋白家族的結(jié)構(gòu)圖及相關(guān)的結(jié)構(gòu)域[43]；（B）DNA 去甲基化的循環(huán)過程。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）將未經(jīng)修飾的 C 轉(zhuǎn)化為 5-mC。5-mC 可以轉(zhuǎn)換回尿嘧啶（U）。經(jīng) TET 介導(dǎo)氧化成 5-hmC、5-fC和 5-caC，然后切除 5-fC 或 5-caC 結(jié)合堿基切除修復(fù)（活性修飾-活性去除（AM-AR）的過程）或依賴復(fù)制稀釋的 5-hmC、5-fC 或 5-caC（活性修飾的過程）[53]。1.2.2 紅系發(fā)育中 TET2 研究進(jìn)展TET2在造血干細(xì)胞中扮演著重要的角色，小鼠和人類的造血細(xì)胞中均表達(dá)，尤其小鼠的造血干/祖細(xì)胞（Hematopoietic stem/progenitors cells，HSPC）中高表達(dá)[55]，Tet2 缺失導(dǎo)致小鼠造血功能異常，具有較強(qiáng)的自我更新能力、造血再生能力增強(qiáng)和向髓系細(xì)胞優(yōu)先分化的特點(diǎn)[56-58]。2011 年，徐明江等人建立了 Tet2敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞 5-hmC 水平顯著降低和 5-mC 水平升高，并且增加了髓系惡性腫瘤發(fā)生前的 LSK（linnegSca1+cKit+）細(xì)胞池，其 LSK 細(xì)胞具有較強(qiáng)的造血再生能力，細(xì)胞分化也發(fā)生了改變。此外，大約 1/3 Tet2-/-和 8% Tet2+/-缺失 的 小鼠 在 2 至 4 月齡 時 ，出 現(xiàn)了 類似 慢 性髓 系白 血 病 （ Chronicmyelomonocytic leukemia，CMML）的表型，這是因為髓系惡性腫瘤比如髓系白

7圖 1.3 MDSs 患者細(xì)胞的形態(tài)和 TET2 是 MDSs 疾病的高頻突變基因。（A）MDSs 患者（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）；（B）MDSs 細(xì)胞形態(tài)（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）；（C）AML 細(xì)胞形態(tài)（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）；（D）MDSs 疾病高頻突變基因[64]。1.2.4 MDSs 與凋亡MDSs 常伴凋亡增強(qiáng)[65]。早年研究表明，和正常人骨髓（NBM）相比，MDSs中 RA/RARS 和 RAEB 中細(xì)胞凋亡明顯增加，P<0.0001（圖 1.4A）[66]，和早期祖細(xì)胞的凋亡高于正常組（圖 1.4B）[67]。另有報道，與 NBM 相比，MDSs 患者骨髓單個核細(xì)胞中 FAS 及其配體 FASL 均表達(dá)上調(diào)（圖 1.4C）[68]。目前，MDSs疾病中產(chǎn)生的凋亡是否通過 FAS 下游的信號分子 Caspase 3 起作用，其詳細(xì)機(jī)制還有待與進(jìn)一步地探究。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 于吉峰,席雨人;紅系祖細(xì)胞體外培養(yǎng)研究進(jìn)展[J];河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1988年S1期

2 劉聰艷,萬歲桂,徐娟,盧遠(yuǎn)清,田丁;非EPO依賴性紅系祖細(xì)胞培養(yǎng)與真性紅細(xì)胞增多癥[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2002年04期

3 鄒春華,胡小利,薜增軍,何國強(qiáng),李素芝,牟信兵;高原紅細(xì)胞增多癥骨髓前紅系祖細(xì)胞體外培養(yǎng)動態(tài)觀察[J];西南國防醫(yī)藥;1999年02期

4 黃紹良;李文益;侯玲玉;杜宏微;李樹濃;;人胎盤血粒單系和紅系祖細(xì)胞體外培養(yǎng)觀察[J];中國實用兒科雜志;1994年04期

5 戴春花,沈澤霜,李梅生;關(guān)于正常人及獻(xiàn)血員循環(huán)紅系祖細(xì)胞測定的初步觀察[J];湖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1986年02期

6 ;日專家用鼠胚胎干細(xì)胞建立紅系祖細(xì)胞系[J];廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2008年02期

7 孟強(qiáng);王世春;王甜甜;陳藝心;張強(qiáng);黃梅莓;趙樹銘;;人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞體外擴(kuò)增生成紅系集落并構(gòu)建紅系祖細(xì)胞株的研究[J];中國輸血雜志;2015年05期

8 肖衛(wèi)國,歐鳳榮,張麗君,于錦香,翟明,澤田賢一;腫瘤壞死因子α對紅系祖細(xì)胞造血影響的實驗研究[J];中華血液學(xué)雜志;2003年08期

9 郭瑞清,祝彼得;小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對紅系祖細(xì)胞增殖的影響[J];青島醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1991年01期

10 ;紅系祖細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得成功[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1985年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 薄華本;當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控紅系祖細(xì)胞分化的機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

2 謝印良;TGF-β信號通路對人多潛能干細(xì)胞來源紅系祖細(xì)胞分化調(diào)節(jié)機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 李陳梅;TET2缺失導(dǎo)致紅系祖細(xì)胞功能異常的機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2019年

2 孟強(qiáng);人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞體外擴(kuò)增生成紅系集落并構(gòu)建紅系祖細(xì)胞株的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 王若永;體外誘導(dǎo)人臍帶血造血干細(xì)胞分化為脫核紅細(xì)胞及功能鑒定的實驗研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

4 賀景頤;維生素A缺乏對貧血的影響及機(jī)制研究進(jìn)展[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

5 曲佳;再生障礙性貧血骨髓CD64～+細(xì)胞比例及其對造血的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

本文編號：2866577