【目的】探討鋅指蛋白667(zinc finger protein 667,ZNF667)對脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制。【方法】(1)以Raw264.7巨噬細(xì)胞系為研究對象,采用LPS誘導(dǎo)建立炎癥巨噬細(xì)胞模型,蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)檢測細(xì)胞ZNF667蛋白表達(dá)水平的變化;(2)采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)建立ZNF667過表達(dá)巨噬細(xì)胞,通過WB、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測LPS刺激后誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、白介素(interlukin,IL)-1β表達(dá)水平的變化,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測LPS刺激后細(xì)胞上清液炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平;(3)采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)建立過表達(dá)ZNF667或抑制ZNF667表達(dá)巨噬細(xì)胞,通過WB檢測LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達(dá)及磷酸化水平的變化;(4)采用雙熒光素酶報告基因和WB分別檢測過表達(dá)ZNF667對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)轉(zhuǎn)錄活性及NF-κB p65、p38促分裂素原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)表達(dá)及磷酸化水平的影響;(5)采用RT-PCR和WB法分別檢測過表達(dá)ZNF667或抑制ZNF667表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)、6磷酸果糖2激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)表達(dá)水平的影響,并采用化學(xué)比色法檢測細(xì)胞上清液中葡萄糖消耗率及乳酸生成的變化;(6)采用RT-PCR檢測己糖激酶抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-Glucose,2-DG)對LPS誘導(dǎo)的低表達(dá)ZNF667巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-1β、iNOS表達(dá)水平的影響;(7)采用RT-PCR檢測mTOR抑制劑Rapamycin(RPM)對LPS誘導(dǎo)的過表達(dá)ZNF667或抑制ZNF667表達(dá)巨噬細(xì)胞中HK2、PFKFB3 mRNA表達(dá)水平的影響,并采用化學(xué)比色法檢測細(xì)胞上清液中葡萄糖消耗率及乳酸生成的變化。【結(jié)果】(1)采用濃度分別為50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml LPS處理細(xì)胞12h后,ZNF667蛋白表達(dá)上調(diào)且以100 ng/ml處理組變化最為顯著;采用100 ng/ml LPS分別處理細(xì)胞6h、12h、24h、48h后,ZNF667蛋白表達(dá)上調(diào)且以12h處理組變化最為顯著;(2)過表達(dá)ZNF667能夠顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性因子IL-1β、iNOS的mRNA和蛋白表達(dá),并抑制細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌;(3)過表達(dá)ZNF667能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平上調(diào);(4)過表達(dá)ZNF667對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性及p65、p38 MAPK、ERK1/2的磷酸化水平未見明顯影響;(5)過表達(dá)ZNF667能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶HK2、PFKFB3 mRNA的表達(dá)上調(diào)和細(xì)胞對葡糖糖的攝取及乳酸生成;(6)抑制ZNF667表達(dá)增強(qiáng)了LPS對巨噬細(xì)胞HK2、PFKFB3 mRNA表達(dá)水平的上調(diào)作用,而糖酵解抑制劑2-DG能夠阻斷此作用;(7)mTOR抑制劑RPM能夠阻斷ZNF667對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶HK2、PFKFB3 mRNA表達(dá)上調(diào)、葡萄糖消耗增加及乳酸生成增多的調(diào)節(jié)作用�！窘Y(jié)論】ZNF667通過mTOR調(diào)節(jié)有氧糖酵解抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果7 在 LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的表達(dá)變度 LPS 對 Raw264.7 巨噬細(xì)胞 ZNF667 蛋白表達(dá)不同濃度的 LPS 處理 Raw264.7 細(xì)胞 12h 建立巨噬細(xì)胞炎實(shí)驗(yàn)檢測 ZNF667 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在 L表達(dá)增加，且隨著 LPS 濃度逐漸增高呈現(xiàn)先上調(diào)后回落的濃度在 100ng/ml 時，ZNF667 蛋白表達(dá)上調(diào)最為顯著，<0.01，圖 1）。

2 LPS 處理不同時間對 Raw264.7 巨噬細(xì)胞 ZNF667 蛋白表（*P <0.05，**P <0.01 vs 0h LPS group，n=3）達(dá) ZNF667 巨噬細(xì)胞的建立質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)建立 ZNF667 過表達(dá) Raw2印跡實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞 ZNF667 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)ZNF667 質(zhì)粒后，Raw264.7 巨噬細(xì)胞 ZNF667 蛋白的表達(dá)空載體細(xì)胞組比較，ZNF667 蛋白的表達(dá)水平提高了約 14

圖 2 LPS 處理不同時間對 Raw264.7 巨噬細(xì)胞 ZNF667 蛋白表達(dá)（*P <0.05，**P <0.01 vs 0h LPS group，n=3）表達(dá) ZNF667 巨噬細(xì)胞的建立用脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)建立 ZNF667 過表達(dá) Raw264.疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞 ZNF667 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3.1-ZNF667 質(zhì)粒后，Raw264.7 巨噬細(xì)胞 ZNF667 蛋白的表達(dá)水平染空載體細(xì)胞組比較，ZNF667 蛋白的表達(dá)水平提高了約 14 倍（
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本文編號：2864114