研究背景:心力衰竭(heart failure,HF)是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段,對(duì)于心力衰竭的治療目標(biāo)不僅僅限于對(duì)癥治療,更重要的是阻斷甚至逆轉(zhuǎn)正常的心臟組織向不可逆病理組織學(xué)的轉(zhuǎn)化,現(xiàn)在越來越多的研究表明心力衰竭的發(fā)生發(fā)展與某些基因的表達(dá)及功能發(fā)揮密切相關(guān),基因治療越來越成為一種治療心力衰竭的新的前景,而微小RNA(miRNAs)已成為治療心力衰竭的潛在靶標(biāo)。miR-1是心臟組織中表達(dá)量最高且僅在心肌中表達(dá)的miRNA,已有研究表明miR-1可以在心力衰竭發(fā)展的適應(yīng)階段逆轉(zhuǎn)心肌肥大,但是若心力衰竭已進(jìn)展到適應(yīng)不良階段后,miR-1是否仍然可以逆轉(zhuǎn)心臟功能障礙并改善心臟重塑是未知的。研究目的:1.成功建立心力衰竭小鼠模型,驗(yàn)證心力衰竭小鼠心臟組織中Dicer及miRNAs的差異表達(dá)。2.探索miR-1a-3p對(duì)心力衰竭小鼠是否有治療作用。3.初步研究miR-1a-3p治療心力衰竭小鼠的機(jī)制。研究方法:1.連續(xù)28天分別每天以異丙腎上腺素60mg/kg誘導(dǎo)小鼠發(fā)生心力衰竭,28天后對(duì)各組小鼠行超聲心動(dòng)圖檢測(cè);取心臟組織觀測(cè)心臟大體觀,分別記錄心臟重量、肺臟重量與體重的比值;石蠟切片行HE染色觀察肌纖維排列及形態(tài)、天狼星紅染色觀察心肌纖維化、麥胚凝集素(WGA)染色觀察細(xì)胞肥大,評(píng)估心臟重塑的情況;酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定血清NT-proBNP表達(dá)水平;確定連續(xù)28天每天腹腔注射異丙腎上腺素60mg/kg是否可以成功誘導(dǎo)小鼠心力衰竭。2.建立小鼠心力衰竭模型后,取心臟組織行蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western blotting)檢測(cè)Dicer蛋白的表達(dá),行實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè)衰竭心臟中miR-1a-3p、miR-133a-3p、miR-195a-5p,miR-208a-3p及miR-499-5p的表達(dá)。3.向發(fā)生心力衰竭的小鼠尾靜脈注射miR-1a-3p agomir(agomir-1),qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,治療前后行超聲心動(dòng)圖檢測(cè),ELISA測(cè)定各組小鼠血清NT-proBNP表達(dá)水平,評(píng)估m(xù)iR-1a-3p能否改善心功能。4.取完整心臟組織觀察大體形狀,分別記錄心臟重量、肺臟重量與體重的比值。5.石蠟切片行HE染色觀察肌纖維排列及形態(tài)、天狼星紅染色后分別在光鏡下觀察心肌纖維化和在偏振光顯微鏡下進(jìn)行膠原纖維分型、WGA染色觀察細(xì)胞肥大、TUNEL染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)、Ki67免疫熒光染色分析細(xì)胞增殖以及過碘酸雪夫氏染色(PAS)檢測(cè)心臟組織糖原沉積情況,評(píng)估m(xù)iR-1a-3p是否改善心臟重塑。6.采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)miR-1a-3p治療后Dicer的表達(dá)情況;運(yùn)用Western blotting及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)miR-1a-3p的靶基因線粒體編碼的NADH脫氫酶1(ND1)和線粒體編碼的細(xì)胞色素c氧化酶I(COX1)的表達(dá)及線粒體Ca~(2+)單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCU)的表達(dá)情況;為了排除全球效應(yīng)的影響運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測(cè)線粒體基因COX2、COX3及ND5的表達(dá),分析補(bǔ)償性輸入miR-1a-3p是否通過調(diào)控其靶基因ND1、COX1及MCU的表達(dá)改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心力衰竭。研究結(jié)果:1.連續(xù)28天每天以60mg/kg的劑量腹腔注射異丙腎上腺素期間,小鼠出現(xiàn)毛發(fā)脫落、體重減輕、攝食下降及活動(dòng)量減少等表現(xiàn),28天后成功誘導(dǎo)小鼠心功能惡化及心臟重構(gòu),建立小鼠心力衰竭模型。2.衰竭的心臟組織中Dicer表達(dá)水平明顯降低,其下游產(chǎn)物miR-1a-3p、miR-133a-3p表達(dá)明顯下降,miR-195a-5p、miR-208a-3p及miR-499a-5p表達(dá)明顯增高。3.向心衰的小鼠進(jìn)行尾靜脈注射agomir-1可恢復(fù)心臟中miR-1a-3p的表達(dá)。4.補(bǔ)償性輸入agomir-1可以減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心功能惡化:輸入agomir-1后小鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)(EF)及左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)明顯增加,血清NT-proBNP水平明顯降低但是仍然高于空白組。5.補(bǔ)償性輸入agomir-1明顯改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心臟重構(gòu):心臟大體觀可見miR-1a-3p治療組的小鼠心臟明顯減小,心重體重比及肺重體重比明顯降低;HE染色可見心肌細(xì)胞排列紊亂減輕、天狼星紅染色光鏡下顯示間質(zhì)纖維化明顯減少、WGA染色可見細(xì)胞肥大減輕、TUNEL免疫熒光染色顯示凋亡的細(xì)胞明顯減少、Ki67免疫熒光染色可見細(xì)胞增殖減少及PAS染色提示心肌組織糖原沉積情況減輕;此外,天狼星紅染色偏振光顯微鏡下可見治療后Ⅰ型膠原纖維減少。6.補(bǔ)償性輸入agomir-1后并未改變Dicer的表達(dá),但是明顯增加其靶基因ND1及COX1的表達(dá),而線粒體編碼的COX2、COX3及ND5的表達(dá)較模型組相比并無明顯改變。7.補(bǔ)償性輸入agomir-1后明顯降低其靶基因MCU的表達(dá)。研究結(jié)論:1.每天連續(xù)以60mg/kg的劑量腹腔注射異丙腎上腺素可以成功誘導(dǎo)小鼠心力衰竭模型,并且衰竭的心臟組織中Dicer及其下游產(chǎn)物miR-1a-3p表達(dá)降低。2.補(bǔ)償性輸入agomir-1可以明顯改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心力衰竭。3.miR-1a-3p可能通過增加ND1和COX1的表達(dá),減少M(fèi)CU的表達(dá)改善心力衰竭。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R541.6
【部分圖文】：

11 只小鼠存活。我們發(fā)現(xiàn)死亡的14 只小鼠的心臟有不同程度的增大。此外，所有存活的小鼠都出現(xiàn)食欲不振（圖3.1 B）、體重減輕（圖 3.1 D）、毛發(fā)脫落（圖 3.1 C）和運(yùn)動(dòng)量減少等表現(xiàn)。圖 3.1 異丙腎上腺素誘導(dǎo)期間小鼠出現(xiàn)的癥狀Figure 3.1 Symptoms of mice during isoproterenol induction

注射異丙腎上腺素的小鼠表現(xiàn)出左心室收縮功能受損（圖3.2A）。具體而言，LVIDD 和 LVIDS 分別增加超過 17％和 46％（圖 3.2 C-D）。此外，EF 和 FS 分別下降超過 23％和 33％（圖 3.2 E-F）。再者，ISO 注射小鼠中NT-proBNP 水平的增加也表明心臟功能受損（圖 3.2 B）。圖 3.2 異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重心臟功能障礙Figure 3.2 Severe cardiac dysfunction in mice exposed to ISO.A: Representative raw tracings of M-mode echocardiography. B: NT-proBNP in serum by ELISA.*P < 0.05 vs CON, mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. C-F: Echocardiographicmeasurements of left ventricular internal diameters in diastole (LVIDD, mm) (C); left ventricularinternal diameters in systole (LVIDS, mm) (D); left ventricular ejection fraction (EF, %) (E); leftventricular fractional shortening (FS, %) (F). *P < 0.05, **P<0.01 vs CON; mean ± SEM, n = 3 forCON and 3 for ISO.在注射異丙腎上腺素 28 天后，小鼠心臟顯著增大，并且它們的心臟重量與體重比和肺重量與體重比均增加 20％以上（圖 3.3A-C）。組織學(xué)檢查顯示，心臟出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞排列紊亂（圖 3.3 D）、嚴(yán)重的間質(zhì)纖維化（圖 3.3 E）和心肌細(xì)胞肥大（圖 3.3 F）。

圖 3.3 異丙腎上腺素誘導(dǎo)后小鼠心臟形態(tài)。Figure 3.3 Heart morphology in mice after exposure to ISO.ross anatomical features of the hearts. B: The ratio of heart weight to body weight. *P < 0N; mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. C: The ratio of lung weight to body weight vs CON; mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. D: HE staining of cross sections rts. E: Assessment of myocardial fibrosis by Sirius Red staining. Quantified fibrotic area. .0001; mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. F: Determination of cardiomyocyte ceGA staining analysis, cardiomyocyte cross-sectional area (m2) measurements. 衰竭的心臟組織中 Dicer、miR-1a-3p 和 miR-133a-3p 表達(dá)下降，并且 miR-195a-5p、miR-208a-3p 和 miR-499-5p 的表平升高。
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1 何芮;miR-1a-3p改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心力衰竭及其機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2863657