全世界范圍內(nèi)受心房顫動(Atrial Fibrillation,AF)影響的人群超過3000萬人。盡管現(xiàn)如今在房顫患者的管理方面取得了一定進展,但是此類心律失常引起的血栓仍然是導致卒中的主要原因之一,而且房顫也增加了心衰等心血管疾病和猝死的發(fā)病風險。年輕人發(fā)生房顫比較罕見,其患病率隨著年齡的增長而增加。遺傳因素和環(huán)境因素及其相互作用是導致房顫發(fā)生的主要原因。許多涉及離子通道的基因突變都能導致房顫,比如KCNQ1、KCNH2、SCN5A、SCN3B和GJA5等基因。但是,現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)一些非離子通道的基因如NPPA、NUP155、CAV1和TNNI3的突變,也能導致房顫或增加房顫的易感性。心臟在肌束和局部傳導之間的異質(zhì)性的結(jié)構(gòu)重構(gòu)導致了電重構(gòu),促成了心律失常的折返和延續(xù)。由于在細胞和亞細胞水平的心臟組織的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu),使房顫有著漸進性的特點。NPPA基因編碼心鈉肽蛋白(Atrial Natriuretic Peptide,ANP)。心鈉肽屬于利鈉肽家族(Natriuretic Peptide family,NP_S)成員之一,是一種參與循環(huán)的激素。ANP具有強大的利鈉、利尿、擴血管、抗交感神經(jīng)和抑制腎素-醛固酮活動的作用,也參與調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡和血壓。ANP的主要作用受體是NPRA(Natriuretic Peptide Receptor A)。NPRA受體是一個鳥苷酸環(huán)化酶,能催化產(chǎn)生重要的第二信使cGMP(Cyclic Guanosine Monophosphate)。第二信使cGMP的產(chǎn)生和其下游的效應(yīng)蛋白激酶G(Protein Kinase G,PKG)能介導細胞內(nèi)參與壓力和生理反應(yīng)的一系列的信號級聯(lián)過程。在之前的研究中,我們實驗室選取了384名孤立性房顫患者,對其NPPA基因做了突變分析,掃描了NPPA所有外顯子和外顯子內(nèi)含子交界處,發(fā)現(xiàn)了一個新的功能未知的改變p.Ile138Thr。ANP由28個氨基酸構(gòu)成,它是由兩個半胱氨酸殘基在第7和23的位置通過一個二硫鍵相連,而p.Ile138Thr突變正好位于環(huán)狀部位的中間位置。這個位置與受體結(jié)合密切相關(guān),在進化中高度保守,是成熟ANP中高度保守區(qū)的第一個導致單個氨基酸改變的突變。但是該突變是否導致房顫需要進一步的證據(jù)證明,而且其導致房顫的分子機制不清楚。因此,該課題在此基礎(chǔ)上,對NPPA基因p.Ile138Thr突變展開深入研究。首先,我們運用生物信息程序預測了NPPA基因p.Ile138Thr突變的致病的可能性。多個生物信息預測程序表明p.Ile138Thr是有害的。基于2015年ACMG(American College of Medical Genetics and Genomics)標準和指南,p.Ile138Thr被定義為一種可能致病變異。然后,為了檢測突變體對受體激活能力的影響。我們利用免疫共沉淀的方法分別鑒定了wANP(wildtype ANP)、mANP(mutant ANP)和其主要受體NPRA的相互作用強度并檢測了wANP和mANP分別刺激后的胞內(nèi)cGMP水平。數(shù)據(jù)表明mANP激活受體NPRA的能力減弱,產(chǎn)生第二信使cGMP的能力也減弱。第三,為證實mANP在動物體內(nèi)是否會導致房顫或房顫易感,我們利用TALEN技術(shù)將NPPA基因p.Ile137Thr突變引入大鼠基因組DNA。我們對10周齡體重在200g到250g之間的大鼠經(jīng)食道快速刺激心房并記錄體表心電圖,并運用超聲技術(shù)檢測大鼠的心臟收縮功能和舒張功能。運用免疫組化實驗方法檢測心臟切片中相關(guān)蛋白和標志物的表達。KI(Knockin)大鼠不僅有自發(fā)的房顫表型,而且相比WT(Wildtype)大鼠,KI大鼠有更長的房顫持續(xù)時間和更高的誘發(fā)率。第四,為確定KI大鼠心房的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生重構(gòu),并確定心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)是否是KI大鼠易房顫的一個可能的機制,我們對大鼠心臟的不同部分進行了Masson三色染色。相比WT大鼠,KI大鼠心臟心房表現(xiàn)出更多的纖維化,心室的纖維化并不顯著,KI大鼠的心臟體重比更高。超聲心動圖結(jié)果表明相比WT大鼠,KI大鼠有高動力性的左室功能。心臟的免疫組化實驗表明,相比WT大鼠,KI大鼠心臟中IL-1β的表達量顯著增高,纖維化相關(guān)基因Col1和MMP9,白細胞的標志物CD45表達均高于WT大鼠,KI大鼠呈現(xiàn)出炎癥反應(yīng)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)。從WT和KI大鼠中分離心臟成纖維細胞和心肌細胞,KI大鼠中成纖維細胞p-p65,p65表達均高于WT大鼠。第五,用血管緊張素II(Angiotensin II,AngII)聯(lián)合wANP或mANP處理了乳鼠成纖維細胞。然后進行了高通量RNA測序。mANP處理組中顯著富集到了TNF-α和NF-κB信號通路。RT-PCR驗證實驗也證實了mANP組較wANP組中Tnfa的mRNA表達量上調(diào)了4倍。KI大鼠成纖維細胞中?-SMA的表達高于WT大鼠。我們分別用mANP和wANP加AngII或者不加單獨刺激大鼠乳鼠心肌細胞。相比wANP組,mANP能夠顯著促進心肌成纖維細胞的增殖。成纖維細胞的標志物vimentin和增殖標志物Ki67共同染色,結(jié)果表明p.Ile138Thr突變能促進心肌成纖維細胞的增殖。這是第一個敲入成熟ANP突變的大鼠模型,敲入NPPA基因p.Ile138Thr突變的大鼠能夠在動物體內(nèi)導致房顫易感。我們的研究揭示了一個基于成纖維細胞導致房顫易感的分子機制。mANP通過減少與受體的結(jié)合能力,降低細胞內(nèi)第二信使cGMP的產(chǎn)生;mANP還可激活TNF-α和NF-κB信號通路激活,從而誘導炎癥反應(yīng),加速心臟的結(jié)構(gòu)重構(gòu),促進成纖維細胞的增殖,最終造成KI動物房顫的發(fā)生或易感。因此,這一研究發(fā)現(xiàn)房顫發(fā)生發(fā)展的一新分子機制。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R541.75
【部分圖文】：

圖 1.1 房顫危險因素可引起以纖維化、炎癥、細胞和分子變化為特征的心房結(jié)構(gòu)和組織病理學改變。遺傳因素、年齡、性別、種族、運動、吸煙、體重、糖尿病、睡眠呼吸暫停、血壓、心力衰竭和心肌梗死都是房顫的危險因素。BMI，體重指數(shù)；HF，心力衰竭；MI，心肌梗死；OSA，睡眠呼吸暫停。（圖片來源：參考文獻[1]）Figure 1.1Atrial fibrillation (AF) risk factors can cause structural and histopathological changes inthe atrium characterized by fibrosis, inflammation, cellular and molecular changes. Genetic factors, age,sex, race, exercise, smoking, weight, diabetes, sleep apnea, blood pressure, heart failure and myocardialinfarction are all risk factors forAF. BMI, body mass index; HF, heart failure; MI, myocardial infarction;OSA, sleep apnea. (Picture source: Reference[1])到目前為止，房顫的發(fā)生機制仍然沒有被完全研究透徹。房顫涉及心房的電變化，結(jié)構(gòu)變化和離子通道的變化等，這些被統(tǒng)稱為心房重構(gòu)。心房的電生理異常，作為房顫的結(jié)果，同時也能維持并加重房顫。心房的結(jié)構(gòu)異常也能導致電異常。已經(jīng)有研究表明，纖維化可能損害心房傳導的局部水平[34]。局部心房傳導異常可為單向傳導減慢或傳導阻滯以及心房再入性心律失常的發(fā)生和維持提供依據(jù)[35]。心房纖維化的發(fā)

7利鈉肽的氨基酸結(jié)構(gòu)(ANP、BNP、CNP)。3 種多肽都具有相成熟 ANP，BNP，CNP 的保守氨基酸序列。（圖片來源：文獻mino acid structure of three natriuretic peptides (ANP, BNP, CNPmino acid rings. The shaded circles represent the conserved amin and CNP. (Picture source: Reference[87] )利鈉肽受體

10圖 1.2.2 配體依賴性激活和 NPRA、NPRB、NPRC 生理功能的圖示。ANP 結(jié)合激活 NPRA，通過刺激和激活依賴于 ANP 的細胞和生理反應(yīng)，促進第二信使 cGMP 的產(chǎn)生。CNP 激活 NPRB，三個 NP 均激活 NPRC。心鈉肽，ANP；腦鈉肽，BNP；c 型利鈉肽，CNP；LBD，配體結(jié)合域；TM，跨膜域；KHD，激酶樣同源域；DD，二聚作用域；GCD，鳥苷酸環(huán)化酶催化域；IP3，三磷酸肌醇。（圖片來源：參考文獻[90]）Figure 1.2.2 Ligand-dependent activation and physiological function of NPRA, NPRB, NPRC. Tcombination ofANP and NPRAactivates the production of the second messenger cGMP by stimulatinand activating ANP-dependent cellular and physiological responses. CNP activates NPRB and all thrNPs activate NPRC. Atrial natriuretic peptide, ANP; Brain natriuretic peptide, BNP; C-type natriuretpeptide,CNP;LBD,ligandbindingdomain;TM,transmembranedomain;KHD,kinase-likehomologodomain; DD, dimerization domain; GCD, functional acylcyclase catalytic domain; IP3, inositol bindin(source: reference [90])
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本文編號：2850919