第一部分 利用CD41敲除小鼠構(gòu)建ITP模型研究背景:免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia,ITP),既往稱之為特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP),是由各種免疫因素介導(dǎo)的出血性疾病,患者主要表現(xiàn)為血小板計數(shù)的顯著降低以及出血風(fēng)險的明顯增高,伴或不伴有出血癥狀。ITP首選的治療方案包括腎上腺糖皮質(zhì)激素和靜脈輸注丙種球蛋白,同時促血小板生成類藥物(如重組人血小板生成素)、抗CD20單克隆抗體(利妥昔單抗)、免疫抑制劑(如環(huán)孢素、達那唑、長春新堿)等其他藥物以及脾切除手術(shù)等諸多方案為ITP患者的治療帶來了希望,但臨床上仍有約1/3的患者對既有的治療方案反應(yīng)欠佳、最終進展成為難治性ITP患者。為深入研究ITP的發(fā)病機制以及試驗新的治療方案,理想的ITP小鼠模型變得尤為重要。根據(jù)小鼠模型的致病特點,可以將其分為三類:被動型ITP小鼠模型、繼發(fā)型ITP小鼠模型以及主動型ITP小鼠模型。前兩種小鼠模型對于研究免疫球蛋白的致病機制、治療以及繼發(fā)性ITP的機制有著積極作用,但對于臨床上更為常見的慢性ITP發(fā)病機制的探究應(yīng)用,顯得有所不足。鑒于此,Semple實驗室用野生型(Wide type,WT)小鼠的血小板免疫CD61敲除(Knock out,KO)小鼠、再將CD61 KO小鼠的脾臟細胞注射給嚴重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠,建立了一種新的主動型ITP小鼠模型。這種小鼠模型有力地促進了慢性ITP的發(fā)病機制及治療方案等方面的研究。然而,有研究證實,CD61 KO雌鼠的胎盤缺陷較為普遍(高達25%),且產(chǎn)后出血概率也高于WT小鼠,這嚴重影響了胚胎及子代小鼠的存活率,增加了動物飼養(yǎng)的成本。CD41同樣作為巨核細胞/血小板的表面標(biāo)志,是否可以利用CD41 KO小鼠替代CD61 KO小鼠、構(gòu)建主動型ITP模型,我們進行了相關(guān)的研究。目的:探究是否可以利用CD41 KO小鼠構(gòu)建主動型ITP模型。方法:1、檢測CD41 KO小鼠的胎盤是否正常、胎鼠以及新生小鼠的出血情況。2、將野生型小鼠的血小板通過尾靜脈輸注給CD41 KO小鼠,待CD41 KO小鼠的外周血抗體陽性率達到標(biāo)準后,摘取并研磨其脾臟細胞,注射給SCID小鼠,檢測SCID小鼠的血小板變化、外周血抗體情況以及骨髓中巨核細胞的變化。3、將野生型小鼠的血小板通過尾靜脈輸注給CD41 KO小鼠,待CD41 KO小鼠的外周血抗體陽性率達到標(biāo)準后,摘取并研磨其脾臟細胞,先進行磁珠分選,再將分選過后的脾臟細胞注射給SCID小鼠,檢測SCID小鼠的血小板變化、外周血抗體情況以及骨髓中巨核細胞的變化。4、將野生型小鼠的血小板通過尾靜脈輸注給CD41 KO小鼠,待CD41 KO小鼠的外周血抗體陽性率達到標(biāo)準后,摘取并研磨其脾臟細胞,注射給切除脾臟的SCID小鼠,檢測SCID小鼠血小板以及外周血抗體情況。結(jié)果:1、在孕14天時檢測小鼠的胎盤及胎鼠,與野生型孕鼠相比,CD41 KO孕鼠的胎盤沒有明顯的異常、子宮及胎鼠沒有明顯的出血、胎鼠個數(shù)也沒有明顯的減少;在生后3天檢測小鼠,CD41 KO新生小鼠皮膚黏膜沒有明顯的出血。2、與注射未免疫野生型小鼠血小板的CD41 KO小鼠脾細胞/或者相等劑量PBS緩沖液的對照組SCID小鼠相比,注射免疫野生型小鼠血小板的CD41 KO小鼠脾細胞的實驗組SCID小鼠的血小板明顯降低、且不會恢復(fù),其外周血抗體明顯增多,其骨髓中成熟巨核細胞明顯減少。3、與注射未進行細胞分選的脾細胞的對照組SCID小鼠相比,注射去除了CD8+T細胞的脾細胞后的實驗組SCID小鼠的骨髓成熟巨核細胞的計數(shù)明顯增多,證實CD8+T細胞或會影響巨核細胞的成熟。4、給脾臟切除的SCID小鼠注射相應(yīng)的脾臟細胞,與未進行脾切除的對照組SCID小鼠相比,其外周血中的抗體量明顯減少,盡管其血小板有一定程度的回升、但仍不能完全恢復(fù)至輻照前水平。結(jié)論:]、主動型ITP小鼠模型能夠更好地模擬慢性ITP的發(fā)病過程、探究不同細胞成分在ITP發(fā)病中的作用。2、CD41 KO小鼠可以替代CD61 KO小鼠、構(gòu)建切實有效的主動型ITP小鼠模型。第二部分HLA-G在ITP發(fā)病中的研究研究背景:ITP是臨床上以血小板計數(shù)顯著降低為主要特征、并排除其他原因?qū)е卵“鍦p少的一種自身免疫性出血性疾病,其發(fā)病機制主要為抗血小板自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增多以及巨核細胞成熟障礙導(dǎo)致的血小板生成減少。ITP患者原本正常的免疫耐受狀態(tài)被打破,抗血小板自身抗體的產(chǎn)生(主要是針對血小板表面糖蛋白(glycoprotein,GP))、細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)的異常活化、輔助性T細胞(helper T cells,Th)亞群中Th1/Th2比例的失衡等,都會不同程度地導(dǎo)致血小板的減少。除此之外,調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)、調(diào)節(jié)性B細胞(regulatory B cells,Bregs)、耐受性樹突狀細胞(dendric cells,DCs)、髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)等多種細胞異常的免疫激活與免疫抑制,亦參與了 ITP發(fā)病過程。人白細胞抗原-G(humanleukocyte antigen-G,HLA-G)是一種非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類抗原,較經(jīng)典的HLA-Ⅰ類抗原而言,HLA-G的多態(tài)性程度低,主要有4種膜結(jié)合型的HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4以及3種可溶性的HLA-G5、HLA-G6、HLA-G7蛋白。HLA-G可通過與相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能,這些受體包括免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物2(immunoglobulin-like transcript 2,ILT2/LILRB1/CD85j)、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物4(immunoglobulin-like transcript 4,ILT4/LILRB2/CD85d)以及殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR2DL4/CD1158d)。其中,ILT2與ILT4被證實是抑制性受體,KIR2DL4可能具有抑制與活化雙重功能。ILT2多見于單核細胞、DCs、B細胞、T細胞以及部分自然殺傷細胞(natural killer cells,NKs)等表面,ILT4局限表達于髓源性單核細胞及DCs上,這兩種ILTs是HLA-G在外周免疫細胞的主要受體;而KIR2DL4則位于子宮蛻膜的NKs表而。HLA-G作為體內(nèi)重要的免疫抑制分子,在自身免疫性疾病的研究中也越來越受到重視。有研究發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者、多發(fā)性硬化患者、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)患者等自身免疫性疾病患者的HLA-G表達水平降低,且低水平的HLA-G與疾病活動性明顯相關(guān)。而關(guān)于HLA-G與ITP的發(fā)病機制的關(guān)聯(lián),尚需進一步研究證實。我們猜測,HLA-G或可在ITP的發(fā)病機制中有著一定的免疫調(diào)控功能,并進行了相關(guān)實驗驗證。目的:探究HLA-G在ITP發(fā)病中的作用及調(diào)控機制方法:1、樣本采集:收集30例ITP患者外周血作為實驗組、15例健康人的外周血作為對照組。2、分離血漿、分選淋巴/單核細胞:密度梯度離心法分離、收集外周血的血漿/血清、單個核細胞(peripheral blood monocyte cells,PBMCs),免疫磁珠分選法分選CD4+T細胞、CD14+單核細胞。3、酶聯(lián)免疫標(biāo)記法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測ITP患者以及正常對照組血漿中HLA-G的表達情況。4、改良單克隆抗體血小板抗原固定實驗(modified monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigen,MAIPA)檢測ITP患者抗血小板自身抗體的表達情況。5、ELISA法檢測ITP患者及正常對照組血清中多種細胞因子的表達水平。6、細胞培養(yǎng):CD14+單核細胞培養(yǎng)體系中,加入粒/巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6),5天后,加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/或重組人HLA-G蛋白(recombined human HLA-G,rhHLA-G)繼續(xù)培養(yǎng)2天,進行相關(guān)檢測。CD4+T細胞培養(yǎng)體系中,加入CD3抗體、重組人IL-2(recombinant human IL-2,rhIL-2),再加入一定數(shù)量的DCs/或rhHLA-G,5天后,進行相關(guān)檢測。結(jié)果:1、與正常對照組相比,抗血小板自身抗體陽性的患者,其HLA-G水平明顯降低,而抗血小板自身抗體陰性的ITP患者,其HLA-G水平則無明顯差異。2、與正常對照組相比,ITP患者CD4+ T細胞以及CD14+單核細胞表面的mHLA-G表達水平明顯降低,其CD4+T細胞表面的ILT2以及CD14+單核細胞表面的ILT4表達水平均明顯降低,而rhHLA-G可以上調(diào)上述ILTs的表達水平。3、rhHLA-G能夠糾正ITP患者的PBMCs分泌紊亂的細胞因子:加入rhHLA-G后,TNF-α、IL-12以及IL-17的水平明顯降低,而IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、G-CSF以及GM-CSF的水平明顯升高。4、ITP患者與正常對照組的成熟DCs表面CD80、CD86的表達均明顯增多,且患者組高于正常對照組;而在加入rhHLA-G后,兩組成熟DCs表面CD80、CD86的表達均顯著性降低;成熟的DCs能明顯促進CD4+ T細胞的增殖,而在加入rhHLA-G后,CD4+T細胞的增殖率明顯降低。結(jié)論:1、ITP患者的HLA-G及ILTs表達水平降低,而rhHLA-G可以上調(diào)相應(yīng)ILTs的表達。2、rhHLA-G可以糾正ITP患者細胞因子的分泌異常、抑制DCs的成熟以及T細胞的增殖,一定程度上糾正ITP患者免疫失耐受狀態(tài)。3、這些機制的發(fā)現(xiàn),或為ITP的發(fā)病機制及治療方案的研究提供重要的參考價值。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R558.2
【部分圖文】：

圖１．免疫血小板后的ＣＤ４１?ＫＯ小鼠外周血抗體流式細胞術(shù)檢測情況??將?ＣＤ４１ＫＯ?小鼠的血清分別稀釋成?１：５０、１：?１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００??，。

１?Ｋ０小鼠基因型鑒定??ＣＤ４１?ＫＯ小鼠基因型。５：?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ?Ｉ，從上至下依次０ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ；?１？４：鑒定野生型基因型，其中Ｏ小鼠ＤＮＡ樣本，４為野生型小鼠ＤＮＡ對照；６？９：鑒定６￣８為待測ＣＤ４１?ＫＯ小鼠ＤＮＡ樣本，９為野生型小鼠Ｄ

圖３．血小板計數(shù)以及外血清抗體變化情況??（Ａ）?口：對照組ＳＣＩＤ小鼠的血小板變化曲線圖，注射了?５?ｘ?１０４個ＣＤ４１?Ｋ０小??鼠的脾細胞（未免疫ＷＴ小鼠的血小板，ｎ?＝?６）；?〇：對照組ＳＣＩＤ小鼠的血小板??變化曲線圖，注射了相等劑量的ＰＢＳ溶液（ｎ?＝?６）；?Ａ：實驗組ＳＣＩＤ小鼠的血??
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2 祁爍;李天天;何昊;董青;田劭丹;徐玥;孫艷平;鄭蕾;陳志雄;陳信義;;強的松對ITP模型小鼠血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)作用研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2017年34期

3 范穎,馬驥,陶淑春;紫癜顆粒對ITP模型小鼠血小板、T亞群及細胞因子的影響[J];中國實驗方劑學(xué)雜志;2005年04期

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1 李欣;利用CD41敲除小鼠構(gòu)建ITP模型以及HLA-G在ITP發(fā)病中的研究[D];山東大學(xué);2019年

本文編號：2849332