第一部分 建立胸腔閉合式小鼠心肌缺血再灌注損傷模型研究背景:缺血性心臟病是引起全球人口死亡的第一位因素,嚴重威脅人類健康。缺血再灌注損傷加重心肌損害,是導致疾病預后不良的重要因素。因此,探尋防治缺血再灌注損傷的有效治療方法有利于改善缺血性心臟病患者預后。本實驗將建立不同于以往胸腔開放式模型,擬建立一種胸腔閉合式小鼠心肌缺血再灌注損傷模型,以期減少手術(shù)創(chuàng)傷應激對心肌缺血再灌注損傷實驗的影響,從而為探尋治療藥物提供基礎。目的:建立一種胸腔閉合式小鼠心肌缺血再灌注損傷模型。方法:采用10-12周齡C57BL/6野生型雄性小鼠,異氟醚麻醉后行氣管插管接呼吸機通氣,顯微鏡下沿左鎖骨中線第四肋間隙開胸,建立心肌缺血再灌注損傷預模型;待小鼠復蘇后,常規(guī)飼養(yǎng)5天,再在靜脈麻醉下行缺血再灌注損傷實驗;分別予以缺血30 min或60 min,再灌注2 h或24 h,取小鼠心臟,TTC染色檢測心肌梗死面積或者TaqMan探針Real-Time PCR技術(shù)測定心肌組織炎癥因子表達水平。結(jié)果:(1)胸腔閉合式小鼠心肌缺血再灌注模型可成功誘導心肌梗死。缺血30min,再灌注2h或24h后,TTC染色觀察到小鼠心肌梗死發(fā)生,并且再灌注24h較2h心梗面積增加;缺血30 min或60 min后,再灌注24 h后,TTC染色觀察到小鼠心肌梗死發(fā)生,但是缺血60min與30min比較,心肌梗死面積無顯著差異;(2)缺血再灌注損傷顯著增加心肌組織炎癥因子水平。小鼠心肌缺血30 min,再灌注2 h后,胸腔閉合式心肌缺血再灌注預模型小鼠(術(shù)后恢復5天后,sham組)與正常健康小鼠相比(contol組)其炎癥因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6均無明顯變化;但是,缺血再灌注損傷小鼠(I/R組)心肌組織IL-1β、IL-6水平顯著高于sham組和control組小鼠。結(jié)論:成功建立胸腔閉合式小鼠心肌缺血再灌注損傷模型,為后續(xù)實驗建立了研究基礎。第二部分 CpG-ODN后處理在心肌缺血再灌注損傷中的保護作用研究研究背景:缺血后處理(ischemic postconditioning,IPC)是只在缺血發(fā)生后,再灌注前或者再灌注起始階段,進行反復多次的短暫血流阻斷與恢復處理。研究證實IPC與缺血預處理一樣,能夠誘導并啟動機體內(nèi)源性保護機制,對心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用。CpG-ODN是TLR9的配體,具體調(diào)節(jié)機體免疫炎癥功能。研究表明CpG-ODN預處理能夠減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷心肌梗死面積,改善小鼠心臟功能。但是,CpG-ODN后處理是否具有同樣作用,尚不清楚。目的:探討CpG-ODN后處理在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的保護作用。方法:為了探討CpG-ODN后處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷早期預后的保護作用,實驗分為三個組,分別為①PBS組:在恢復再灌注前5 min給予腹腔注射PBS 250μl;②IPC組:在完成缺血30 min后,給予再灌注20 s后緊接著缺血20 s,循環(huán)3次;③CpG-ODN組:在恢復再灌注前5 min給予腹腔注射CpG-ODN(0.2 μmol/kg,溶解于250μl PBS中)。所有實驗組小鼠在完成缺血30min,再灌注2h和24h后,取小鼠心臟,TTC染色檢測小鼠心肌梗死面積;并且在再灌注24 h后通過置入左心室P-V導管評估小鼠的心臟功能。為了探討CpG-ODN對小鼠心肌缺血再灌注損傷遠期預后的保護作用,實驗分為四個組,分別為①sham組:小鼠只進行缺血再灌注損傷預模型的建立,并不行缺血再灌注干預;①PBS組:在恢復再灌注前5 min給予腹腔注射PBS 250 μl;②IPC組:在完成缺血30 min后,給予再灌注20s后緊接著缺血20s,循環(huán)3次;③CpG-ODN組:在恢復再灌注前5 min給予腹腔注射CpG-ODN(0.2 μmol/kg,溶解于250 μ1 PBS中)。除sham組外,其它實驗組小鼠在完成缺血30 min,再灌注7 days和28 days后,取小鼠心臟,天狼星紅染色法檢測心肌組織膠原纖維沉積水平,評估心肌纖維化程度;再灌注3 days和7 days后,取小鼠心臟,免疫組化檢測心肌組織巨噬細胞浸潤程度;再灌注3 days、7 days和28 days后通過置入左心室P-V導管評估小鼠的心臟功能。結(jié)果:(1)與PBS組相比,CpG-ODN后處理和IPC處理均顯著降低小鼠再灌注2h和24 h心肌梗死面積。(2)與PBS組相比,CpG-ODN后處理顯著增加小鼠再灌注24 h左心室功能指標包括射血分數(shù)(ejection fraction,EF)和前負荷補充搏功(preload recruitable stroke work,PRSW),改善小鼠心臟功能;(3)與PBS組相比,CpG-ODN后處理和IPC顯著降低小鼠再灌注后7 days和28 days心肌組織膠原纖維沉積;(4)與PBS組相比,CpG-ODN后處理顯著減少小鼠再灌注后3 days和7 days心肌組織巨噬細胞浸潤,IPC處理僅顯著減少小鼠再灌注后3 days心肌組織巨噬細胞浸潤;(5)與PBS組相比,CpG-ODN顯著增加小鼠再灌注后3 days、7 days和28 days EF和PRSW值,顯著改善小鼠心臟功能;IPC處理僅增加小鼠再灌注3 days EF和PRSW值。結(jié)論:CpG-ODN不僅減少心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌梗死面積,改善早期心臟功能,而且降低小鼠心肌組織膠原纖維沉積和巨噬細胞浸潤,改善遠期心臟功能。第三部分 CpG-ODN后處理對心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制研究研究背景:再灌注損傷救援激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)包括 PI3K/Akt、MAPKs和ERK1/2等被認為是缺血后處理(ischemicpostconditioning,IPC)改善心肌缺血再灌注損傷預后的關(guān)鍵信號機制。CpG-ODN作為一種人工合成的模擬細菌DNA成分的寡聚脫氧核苷酸,與其受體TLR9(Toll like receptor 9,TLR9)結(jié)合后,參與調(diào)節(jié)機體免疫炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)CpG-ODN預處理通過活化PI3K/Akt信號通路和調(diào)節(jié)IL-10炎癥因子,從而減少缺血再灌注損傷小鼠心肌梗死面積,改善小鼠心臟功能。然而,CpG-ODN后處理對心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制如何,尚不清楚。目的:探討CpG-ODN后處理減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機制。方法:實驗將分為三個組,分別為①PBS組:在恢復再灌注前5 min給予腹腔注射PBS 250 μl;②IPC組:在完成缺血30 min后,給予再灌注20s后緊接著缺血20s,循環(huán)3次;③CpG-ODN組:在恢復再灌注前5 min給予腹腔注射CpG-ODN(0.2μmol/kg,溶解于250 μl PBS中)。在完成缺血30 min,再灌注2 h后,取小鼠心臟,TaqMan探針Real-Time PCR技術(shù)檢測心肌組織炎癥因子水平;進一步,采用C57BL/6野生型雄性(WT)小鼠以及同系來源的TLR9基因敲除(TLR9-D)小鼠作為研究對象,并且部分WT小鼠采用PI3K抑制劑wortmannin進行干預,完成缺血30min,再灌注2h后,取小鼠心臟,TTC染色檢測小鼠心肌梗死面積。結(jié)果:(1)與IPC組或PBS組相比,CpG后處理顯著誘導小鼠再灌注2 h后心肌組織炎癥因子IL-10表達升高;(2)在WT小鼠中,CpG-ODN后處理顯著減輕小鼠再灌注2h后心肌梗死面積;然而,在TLR9-D小鼠中,CpG-ODN未能減少缺血再灌注損傷小鼠心肌梗死面積;(3)DMSO預處理對照組小鼠中,CpG-ODN和IPC均顯著減少缺血再灌注損傷小鼠心肌梗死面積;然而,在wortmannin預處理小鼠中,CpG-ODN和IPC未能減少缺血再灌注損傷小鼠心肌梗死面積。結(jié)論:CpG-ODN后處理顯著誘導心肌組織抗炎因子IL-10表達升高,并且CpG-ODN對心肌缺血再灌注損傷小鼠的保護作用被TLR9基因敲除和PI3K抑制劑拮抗。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R542.2
【部分圖文】：

圖１．小鼠心肌缺血再灌注損傷實驗流程圖??２．２．２具體實驗步驟??第一階段：建立胸腔閉合式小鼠缺血再灌注損傷預模型（圖２）??（１）將小鼠放入麻醉誘導容器中，容器的一端連接異氟醚揮發(fā)灌裝置，打開??揮發(fā)灌，將異氟醚的吸入溶度調(diào)至３．０?Ｖｏｌ％，氧流量調(diào)節(jié)至０．５?Ｌ／ｍｉｎ；??（２）待小鼠失去意識，并且觸覺刺激反應和四肢撤退反射消失之后，將小鼠??轉(zhuǎn)移到恒溫控制的小動物外科手術(shù)臺，予以平臥位，將口鼻部對準異氟醚吸入麻??醉劑圓錐形出口，以便繼續(xù)維持小鼠一定的麻醉深度，并用一?５－０尼龍線通過固定??小鼠的上牙齒使其頭部保持水平位置，以便于氣管插管。??（３）從肛門插入肛溫探頭，維持小鼠體溫在３７°Ｃ，用膠帶固定小鼠四肢，將??小鼠的左下肢斜跨小鼠右上肢

圖３．心肌缺血再灌注損傷實驗操作及心電圖表現(xiàn)??第三階段：小鼠心肌缺血再灌注損傷結(jié)果評估??（１）小鼠心臟血菅恢復血供２?ｈ或２４?ｈ后，予以腹腔注射靜脈麻醉劑，氣管??插管接呼吸機通氣；??（２）沿小鼠前正中線，剪開皮膚至劍突，打開腹腔，剪開膈肌，用縫線將前??胸壁向小鼠頭端牽引并固定，充分暴露胸腔、心臟及周圍組織；??（３）小心處理埋在皮下的８－０環(huán)狀線圈，剪開線圈，將兩端線頭打結(jié)，結(jié)扎??ＬＡＤ；??（４）暴露左心房，用ｌｍｌ注射器向左心房緩慢注射１０％?ｐｈｔｈａｌｏ?ｂｌｕｅ，待心臟??組織慢慢變藍后，再向左心房注射１０％氯化鉀溶液，直至心臟停止跳動；??（５）小心切下整個小鼠心臟，放入裝有ＰＢＳ的６０?ｍｍ的培養(yǎng)皿中，漂洗數(shù)次，??

士學位論文?第一部分從冰箱取出心臟，放入小鼠心臟切片裝置（圖４），將心臟組織，并將心臟薄片組織放入裝有１．５％ＴＴＣ的９６孔板中，放入３７°ｉｎ；??將心臟薄片放入載薄片中，兩端墊上１?ｍｍ厚的金屬片后蓋上下，觀察心臟組織壞死情況，拍照保存，并用Ｉｍａｇｅ?Ｊ軟件計算
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡曉鶯;陳振雨;;靜脈淤血型皮瓣缺血再灌注損傷的研究進展[J];中國美容整形外科雜志;2017年04期

2 彭智遠;劉旺華;曹雯;;腦缺血再灌注損傷細胞凋亡機制的研究進展[J];中華中醫(yī)藥學刊;2017年08期

3 李瑞華;闞世廉;李津;;骨骼肌缺血再灌注損傷研究進展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志;2017年04期

4 秦聰;張杰;;缺血再灌注損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡的研究進展[J];醫(yī)學研究雜志;2017年09期

5 宋亞剛;葉林峰;吃安坤;曹慧;沈甜;張曉雙;侯建平;王斌;;5-脂氧酶在腦缺血再灌注損傷中的機制探討[J];中南藥學;2016年04期

6 劉磊;劉麗華;馬玉奎;;腦缺血再灌注損傷機制研究進展[J];藥學研究;2016年09期

7 陳路;李瑋瑋;劉春慧;;制備腦缺血再灌注損傷動物模型的研究進展[J];中國生化藥物雜志;2015年10期

8 朱夢霞;王芳;楊麒玉;黃靚;;硝酸酯后處理對心臟缺血再灌注損傷心肌保護的效果分析[J];現(xiàn)代養(yǎng)生;2017年14期

9 王馨;徐響;俞斌;孫麗萍;;腦缺血再灌注損傷機制及蜂膠抗腦缺血再灌注損傷研究進展[J];中國蜂業(yè);2014年Z2期

10 梁茂本;王國如;丁漣沭;;蓮心堿改善腦缺血再灌注損傷的機制[J];時珍國醫(yī)國藥;2014年10期

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 田洪哲;蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1在腎臟缺血再灌注損傷中的作用與機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學;2019年

2 展希;HO-1對大鼠移植肝膽道缺血再灌注損傷的保護作用研究[D];昆明醫(yī)科大學;2018年

3 包道日娜;通過抑制核因子κB表達在遠端缺血預處理胃缺血再灌注損傷大鼠模型中的保護作用[D];重慶醫(yī)科大學;2017年

4 黃超;MicroRNA-708在腦缺血再灌注損傷中的作用及機制研究[D];鄭州大學;2018年

5 吳水晶;CPG-ODN后處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究[D];浙江大學;2018年

6 魚洋;枸杞多糖對腦缺血再灌注損傷的作用及機制研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學;2018年

7 李諾;高鉀灌注液對不同腦細胞缺血再灌注損傷模型的保護作用及其機制[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

8 蔣玲玲;藥物后處理對心臟/腎臟缺血再灌注損傷的保護作用及信號通路研究[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

9 孟哲;瞬時受體陽離子通道TRPM7在缺血再灌注損傷中的作用機制及應用的研究[D];武漢大學;2015年

10 郭森;IRF4在腦缺血再灌注損傷中的作用與機制研究[D];武漢大學;2015年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 汪繼;MicroRNA-182-5p在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2019年

2 吳超;SIK-2對腦缺血再灌注損傷的影響及機制研究[D];皖南醫(yī)學院;2019年

3 韓子偉;GPER參與雌激素改善腦缺血再灌注損傷的作用研究[D];石河子大學;2019年

4 杜鴻;高遷移率族蛋白B1 （HMGB-1）與腎臟缺血再灌注損傷中炎癥反應關(guān)系的研究[D];西南醫(yī)科大學;2019年

5 谷保紅;細胞焦亡在小鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用研究[D];蘭州大學;2019年

6 王莉紅;CELSR1在腦缺血再灌注損傷中對神經(jīng)修復及再生和血管再生的影響[D];山東大學;2019年

7 侯永英;白藜蘆醇通過JAK2/STAT3/PI3K/AKT/mTOR信號通路對大腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用[D];重慶醫(yī)科大學;2018年

8 屈生彪;鷹嘴豆素A對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護機制初步研究[D];桂林醫(yī)學院;2018年

9 于建軍;白介素-11在小鼠肝臟缺血再灌注損傷中的保護作用[D];南京醫(yī)科大學;2016年

10 鄺曉晨;缺血預處理對甲狀旁腺缺血再灌注損傷保護作用的研究[D];昆明醫(yī)科大學;2018年

本文編號：2848946