研究目的我們通過基因芯片篩選檢測發(fā)現miR-22在主動脈夾層患者主動脈組織樣本中的表達較正常主動脈組織樣本中顯著下調。在動物實驗中,通過主動脈夾層造模研究miR-22對主動脈夾層發(fā)生、管壁生物力學性質及力學性質相關蛋白表達的影響。在細胞實驗中,通過干預平滑肌細胞、內皮細胞內miR-22的表達檢測其對平滑肌細胞、內皮細胞增殖、凋亡功能和力學相關蛋白表達的影響;在內皮細胞和平滑肌細胞非接觸共培養(yǎng)模型中,通過干預內皮細胞中miR-22的表達后檢測平滑肌細胞中力學相關蛋白含量,以及通過干預內皮細胞分泌功能后檢測平滑肌細胞中力學相關蛋白含量,以揭示miR-22影響主動脈管壁生物力學性質和主動脈夾層發(fā)生的機制。研究方法根據前本中心前期芯片結果,我們篩查了在人組織樣本中差異表達的miRNAs,并通過realtime PCR驗證miR-22在主動脈夾層樣本中較正常主動脈組織樣本中顯著下調。在動物實驗中,我們利用3周齡雄性FVB小鼠進行主動脈夾層造模,采用飲用水中添加β-氨基丙腈喂養(yǎng),持續(xù)喂養(yǎng)1個月后,給予尾靜脈注射miR-22Agomir/antagomir,繼續(xù)喂養(yǎng)一周后,在小鼠皮下植入血管緊張素II微泵持續(xù)72h建立主動脈夾層模型。造模結束后,取小鼠主動脈組織樣本,在大體標本上觀察主動脈病變情況,記錄主動脈夾層發(fā)生率;小鼠主動脈標本切片HE染色測量主動脈中膜厚度、管腔直徑并計算中膜厚度管徑比值,小鼠主動脈標本切片EVG染色測量管壁彈力纖維含量,小鼠主動脈標本切片Masson染色測量管壁膠原纖維含量,以檢測miR-22對主動脈管壁血管重構的影響;利用力學測試系統(tǒng)對小鼠主動脈進行力學測試,記錄主動脈厚度、周長、剛度、極限荷載、極限位移、極限應力、極限應變、拉伸比的數值,繪制應力應變曲線,結合Origin軟件通過線性擬合分析計算其彈性模量,以此明確miR-22對主動脈管壁力學性質的影響;主動脈組織TUNEL染色法檢測miR-22對管壁細胞凋亡的影響;免疫組織化學的方法檢測miR-22對管壁力學相關蛋白Rho/ROCK1表達的影響。在細胞實驗中,構建miR-22上調和下調腺病毒,分別感染平滑肌細胞和內皮細胞,用CCK-8法檢測細胞增殖功能變化;利用Annexin V-APC及7-AAD雙染色后流式細胞儀檢測細胞凋亡。干預平滑肌細胞miR-22表達后,提取細胞總蛋白,利用western-blot檢測miR-22對平滑肌細胞力學相關蛋白Rho/ROCK1表達的影響。利用生物信息學方法預測miR-22可能靶向作用的分泌型蛋白,通過ELISA檢測干預miR-22的內皮細胞培養(yǎng)液中蛋白的表達情況以確定miR-22作用的靶蛋白FBXW7。在內皮細胞和平滑肌細胞的非接觸共培養(yǎng)模型中,干預內皮細胞的miR-22表達后,提取平滑肌細胞總蛋白,利用western-blot檢測miR-22作用于內皮細胞對平滑肌細胞力學相關蛋白Rho/ROCK1的表達的影響。合成用于敲減內皮細胞中分泌蛋白FBXW7的siRNA,對共培養(yǎng)模型中的內皮細胞進行干預,檢測平滑肌細胞中力學相關蛋白的表達量,明確miR-22是否通過影響內皮細胞分泌功能進而改變平滑肌細胞中力學相關蛋白ROCK1的表達。結果通過人主動脈組織樣本realtime PCR驗證我們發(fā)現miR-22在主動脈夾層組織中的表達較正常主動脈組織樣本中顯著下調。動物實驗結果顯示:主動脈夾層造模率mir-22上調組為4/12(33.3%),上調對照組為8/12(66.7%),mir-22下調組為7/12(58.3%),下調對照組為5/12(41.7%)。經統(tǒng)計學分析表明,mir-22上調組與上調對照組相比可顯著降低主動脈夾層的發(fā)生率。對小鼠主動脈組織樣本HE染色進行測量并對結果進行統(tǒng)計分析發(fā)現agomir-22組較agomir-NC組小鼠中膜厚度管徑比值明顯增大;對EVG染色測量結果進行統(tǒng)計并分析發(fā)現agomir-22組較agomir-NC組彈力纖維含量顯著增高;對本Masson染色測量結果進行統(tǒng)計并分析發(fā)現agomir-22組較agomir-NC組膠原纖維含量顯著增高。免疫組化結果提示小鼠主動脈組織中力學相關Rho、ROCK1的表達量,miR-22上調組較miR-22下調組明顯降低。小鼠主動脈管壁力學測試結果顯示:agomir-22組較agomir-NC組管壁平均厚度顯著增加,小鼠主動脈管壁周長各組間無明顯差異;agomir-22組與agomir-NC組相比,極限荷載、極限位移、極限應力、極限應變、初始彈性模量、拉伸比均顯著升高,而極限彈性模量、曲線下面積無明顯統(tǒng)計學差異;antagomir-22組較antagomir-NC組極限荷載、極限應力、極限彈性模量、剛度等均降低,而極限位移、極限應變、拉伸比、曲線下面積、初始彈性模量無明顯統(tǒng)計學差異,力學實驗結果表明miR-22表達上調在夾層發(fā)生中起到了保護性作用。細胞實驗結果:干預平滑肌細胞和內皮細胞中的miR-22后檢測細胞功能,結果顯示,下調miR-22可顯著抑制平滑肌細胞的增殖功能、促進其凋亡,同時干預miR-22對平滑肌細胞力學相關蛋白Rho/ROCK1含量無影響。干預miR-22對內皮細胞增殖、凋亡無影響。通過生物信息學方法我們預測了miR-22可能靶向作用的分泌型蛋白FBXW7和TMED4。收集干預miR-22的內皮細胞的培養(yǎng)液,利用ELISA檢測其中FBXW7和TMED4的含量,發(fā)現miR-22上調可顯著降低FBXW7的含量,下調miR-22可顯著提高FBXW7的含量,而干預miR-22對TMED4的含量沒有影響。在內皮細胞和平滑肌細胞無接觸共培養(yǎng)模型中干預內皮細胞miR-22的表達后測定平滑肌細胞中力學相關蛋白Rho/ROCK1含量,結果顯示下調內皮細胞中miR-22的表達可使平滑肌細胞中ROCK1含量升高。而后我們合成了用于敲減FBXW7表達的siRNA,在共培養(yǎng)模型中干預miR-22下調組內皮細胞,隨后檢測平滑肌細胞的ROCK1表達情況,結果表明敲減內皮細胞中FBXW7可以削弱miR-22下調引起的平滑肌細胞中ROCK1蛋白表達量的升高。結論本課題主要研究了miR-22影響主動脈管壁力學性質及其在主動脈夾層發(fā)生的中的作用和機制。1.miR-22在夾層主動脈組織中較正常主動脈組織顯著下調;2.miR-22表達上調可使小鼠主動脈夾層的發(fā)生率降低;3.通過力學檢測發(fā)現上調miR-22可以顯著提高主動脈管壁極限荷載、極限位移、極限應力、極限應變、初始彈性模量、拉伸比等生物力學指標;4.免疫組化結果提示下調miR-22可使小鼠主動脈Rho/ROCK1含量增高;5.下調mir-22對平滑肌細胞增殖功能具有抑制作用,對凋亡能力具有促進作用,但是干預miR-22對平滑肌細胞的力學相關蛋白含量無影響。6.miR-22對內皮細胞的增殖、凋亡功能沒有影響;7.上調miR-22可以抑制內皮細胞分泌FBXW7,對TMED4的分泌沒有影響;8.在內皮細胞和平滑肌細胞非接觸共培養(yǎng)模型中下調內皮細胞的miR-22可使平滑肌細胞中力學相關蛋白ROCK1含量增加;9.miR-22通過影響內皮細胞分泌FBXW7,間接作用于平滑肌細胞使其力學相關蛋白ROCK1的表達發(fā)生改變。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R543.1
【部分圖文】：

圖 1 小鼠主動脈力學測試示意圖在樣本浸泡在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下進行處理；本穿在自制夾具上并固定于力學測試儀的夾具上鼠主動脈環(huán)的單軸拉伸力學測試操作流程主動脈環(huán)用兩個自制碳素鋼絲模具分別穿過，然后將上下兩端分別固器夾具上，因自制模具較細小，可在咬合處加用磨砂紙增加摩擦力（圖電腦控制系統(tǒng)上將荷載及初始位移位置的讀數歸零；具兩端用儀器配送扳手旋緊，確保拉伸過程中被測樣本不會出現滑脫制操作系統(tǒng)開始測量后，系統(tǒng)將開始運行并自動記錄運行過程中的實值；動脈環(huán)斷裂后，系統(tǒng)將繼續(xù)運行，移動至預設位移處自動停止。鼠主動脈管壁形態(tài)學測量驗中小鼠主動脈管壁厚度 T0 及小鼠主動脈管壁周長計算方法：通過

miR-22 對主動脈夾層發(fā)生和管壁生物力學性結果-22 在人主動脈夾層組織樣本中顯著下主動脈夾層 miRNA 差異表達的芯片結果，我s，并利用收集的主動脈夾層患者及正常捐獻者 RNA，逆轉錄得到 cDNA，最后進行 RealtimeiR-491-3p、miR-1284、miR-30a、miR-130a 在人R 實驗結果，我們發(fā)現與正常主動脈組織相比，調（P<0.05），而 miR-491-3p、miR-1284、mi

文應的 miR-22 干預劑，繼續(xù)喂養(yǎng)一周后，除空組皮下植泵血管緊張素Ⅱ。脈 miR-22 干預效果驗證靜脈注射 miR-22 干預劑（agomir-22/antagom影響，小鼠尾靜脈注射一周后處死小鼠，取小PCR 驗證。圖 3 表明，agomir -22 組與 agomir-N差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05），而 anta，可顯著下調小鼠主動脈 miR-22 的表達，差agomir/antagomir 干預方法有效。
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本文編號：2848778