研究目的我們通過基因芯片篩選檢測發(fā)現(xiàn)miR-22在主動脈夾層患者主動脈組織樣本中的表達(dá)較正常主動脈組織樣本中顯著下調(diào)。在動物實驗中,通過主動脈夾層造模研究miR-22對主動脈夾層發(fā)生、管壁生物力學(xué)性質(zhì)及力學(xué)性質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。在細(xì)胞實驗中,通過干預(yù)平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)miR-22的表達(dá)檢測其對平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡功能和力學(xué)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)模型中,通過干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-22的表達(dá)后檢測平滑肌細(xì)胞中力學(xué)相關(guān)蛋白含量,以及通過干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能后檢測平滑肌細(xì)胞中力學(xué)相關(guān)蛋白含量,以揭示miR-22影響主動脈管壁生物力學(xué)性質(zhì)和主動脈夾層發(fā)生的機(jī)制。研究方法根據(jù)前本中心前期芯片結(jié)果,我們篩查了在人組織樣本中差異表達(dá)的miRNAs,并通過realtime PCR驗證miR-22在主動脈夾層樣本中較正常主動脈組織樣本中顯著下調(diào)。在動物實驗中,我們利用3周齡雄性FVB小鼠進(jìn)行主動脈夾層造模,采用飲用水中添加β-氨基丙腈喂養(yǎng),持續(xù)喂養(yǎng)1個月后,給予尾靜脈注射miR-22Agomir/antagomir,繼續(xù)喂養(yǎng)一周后,在小鼠皮下植入血管緊張素II微泵持續(xù)72h建立主動脈夾層模型。造模結(jié)束后,取小鼠主動脈組織樣本,在大體標(biāo)本上觀察主動脈病變情況,記錄主動脈夾層發(fā)生率;小鼠主動脈標(biāo)本切片HE染色測量主動脈中膜厚度、管腔直徑并計算中膜厚度管徑比值,小鼠主動脈標(biāo)本切片EVG染色測量管壁彈力纖維含量,小鼠主動脈標(biāo)本切片Masson染色測量管壁膠原纖維含量,以檢測miR-22對主動脈管壁血管重構(gòu)的影響;利用力學(xué)測試系統(tǒng)對小鼠主動脈進(jìn)行力學(xué)測試,記錄主動脈厚度、周長、剛度、極限荷載、極限位移、極限應(yīng)力、極限應(yīng)變、拉伸比的數(shù)值,繪制應(yīng)力應(yīng)變曲線,結(jié)合Origin軟件通過線性擬合分析計算其彈性模量,以此明確miR-22對主動脈管壁力學(xué)性質(zhì)的影響;主動脈組織TUNEL染色法檢測miR-22對管壁細(xì)胞凋亡的影響;免疫組織化學(xué)的方法檢測miR-22對管壁力學(xué)相關(guān)蛋白Rho/ROCK1表達(dá)的影響。在細(xì)胞實驗中,構(gòu)建miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒,分別感染平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖功能變化;利用Annexin V-APC及7-AAD雙染色后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。干預(yù)平滑肌細(xì)胞miR-22表達(dá)后,提取細(xì)胞總蛋白,利用western-blot檢測miR-22對平滑肌細(xì)胞力學(xué)相關(guān)蛋白Rho/ROCK1表達(dá)的影響。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-22可能靶向作用的分泌型蛋白,通過ELISA檢測干預(yù)miR-22的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中蛋白的表達(dá)情況以確定miR-22作用的靶蛋白FBXW7。在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的非接觸共培養(yǎng)模型中,干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞的miR-22表達(dá)后,提取平滑肌細(xì)胞總蛋白,利用western-blot檢測miR-22作用于內(nèi)皮細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞力學(xué)相關(guān)蛋白Rho/ROCK1的表達(dá)的影響。合成用于敲減內(nèi)皮細(xì)胞中分泌蛋白FBXW7的siRNA,對共培養(yǎng)模型中的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),檢測平滑肌細(xì)胞中力學(xué)相關(guān)蛋白的表達(dá)量,明確miR-22是否通過影響內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能進(jìn)而改變平滑肌細(xì)胞中力學(xué)相關(guān)蛋白ROCK1的表達(dá)。結(jié)果通過人主動脈組織樣本realtime PCR驗證我們發(fā)現(xiàn)miR-22在主動脈夾層組織中的表達(dá)較正常主動脈組織樣本中顯著下調(diào)。動物實驗結(jié)果顯示:主動脈夾層造模率mir-22上調(diào)組為4/12(33.3%),上調(diào)對照組為8/12(66.7%),mir-22下調(diào)組為7/12(58.3%),下調(diào)對照組為5/12(41.7%)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明,mir-22上調(diào)組與上調(diào)對照組相比可顯著降低主動脈夾層的發(fā)生率。對小鼠主動脈組織樣本HE染色進(jìn)行測量并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)agomir-22組較agomir-NC組小鼠中膜厚度管徑比值明顯增大;對EVG染色測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計并分析發(fā)現(xiàn)agomir-22組較agomir-NC組彈力纖維含量顯著增高;對本Masson染色測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計并分析發(fā)現(xiàn)agomir-22組較agomir-NC組膠原纖維含量顯著增高。免疫組化結(jié)果提示小鼠主動脈組織中力學(xué)相關(guān)Rho、ROCK1的表達(dá)量,miR-22上調(diào)組較miR-22下調(diào)組明顯降低。小鼠主動脈管壁力學(xué)測試結(jié)果顯示:agomir-22組較agomir-NC組管壁平均厚度顯著增加,小鼠主動脈管壁周長各組間無明顯差異;agomir-22組與agomir-NC組相比,極限荷載、極限位移、極限應(yīng)力、極限應(yīng)變、初始彈性模量、拉伸比均顯著升高,而極限彈性模量、曲線下面積無明顯統(tǒng)計學(xué)差異;antagomir-22組較antagomir-NC組極限荷載、極限應(yīng)力、極限彈性模量、剛度等均降低,而極限位移、極限應(yīng)變、拉伸比、曲線下面積、初始彈性模量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,力學(xué)實驗結(jié)果表明miR-22表達(dá)上調(diào)在夾層發(fā)生中起到了保護(hù)性作用。細(xì)胞實驗結(jié)果:干預(yù)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-22后檢測細(xì)胞功能,結(jié)果顯示,下調(diào)miR-22可顯著抑制平滑肌細(xì)胞的增殖功能、促進(jìn)其凋亡,同時干預(yù)miR-22對平滑肌細(xì)胞力學(xué)相關(guān)蛋白Rho/ROCK1含量無影響。干預(yù)miR-22對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡無影響。通過生物信息學(xué)方法我們預(yù)測了miR-22可能靶向作用的分泌型蛋白FBXW7和TMED4。收集干預(yù)miR-22的內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)液,利用ELISA檢測其中FBXW7和TMED4的含量,發(fā)現(xiàn)miR-22上調(diào)可顯著降低FBXW7的含量,下調(diào)miR-22可顯著提高FBXW7的含量,而干預(yù)miR-22對TMED4的含量沒有影響。在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞無接觸共培養(yǎng)模型中干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞miR-22的表達(dá)后測定平滑肌細(xì)胞中力學(xué)相關(guān)蛋白Rho/ROCK1含量,結(jié)果顯示下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-22的表達(dá)可使平滑肌細(xì)胞中ROCK1含量升高。而后我們合成了用于敲減FBXW7表達(dá)的siRNA,在共培養(yǎng)模型中干預(yù)miR-22下調(diào)組內(nèi)皮細(xì)胞,隨后檢測平滑肌細(xì)胞的ROCK1表達(dá)情況,結(jié)果表明敲減內(nèi)皮細(xì)胞中FBXW7可以削弱miR-22下調(diào)引起的平滑肌細(xì)胞中ROCK1蛋白表達(dá)量的升高。結(jié)論本課題主要研究了miR-22影響主動脈管壁力學(xué)性質(zhì)及其在主動脈夾層發(fā)生的中的作用和機(jī)制。1.miR-22在夾層主動脈組織中較正常主動脈組織顯著下調(diào);2.miR-22表達(dá)上調(diào)可使小鼠主動脈夾層的發(fā)生率降低;3.通過力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-22可以顯著提高主動脈管壁極限荷載、極限位移、極限應(yīng)力、極限應(yīng)變、初始彈性模量、拉伸比等生物力學(xué)指標(biāo);4.免疫組化結(jié)果提示下調(diào)miR-22可使小鼠主動脈Rho/ROCK1含量增高;5.下調(diào)mir-22對平滑肌細(xì)胞增殖功能具有抑制作用,對凋亡能力具有促進(jìn)作用,但是干預(yù)miR-22對平滑肌細(xì)胞的力學(xué)相關(guān)蛋白含量無影響。6.miR-22對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡功能沒有影響;7.上調(diào)miR-22可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌FBXW7,對TMED4的分泌沒有影響;8.在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)模型中下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的miR-22可使平滑肌細(xì)胞中力學(xué)相關(guān)蛋白ROCK1含量增加;9.miR-22通過影響內(nèi)皮細(xì)胞分泌FBXW7,間接作用于平滑肌細(xì)胞使其力學(xué)相關(guān)蛋白ROCK1的表達(dá)發(fā)生改變。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R543.1
【部分圖文】：
圖 1 小鼠主動脈力學(xué)測試示意圖在樣本浸泡在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下進(jìn)行處理；本穿在自制夾具上并固定于力學(xué)測試儀的夾具上鼠主動脈環(huán)的單軸拉伸力學(xué)測試操作流程主動脈環(huán)用兩個自制碳素鋼絲模具分別穿過，然后將上下兩端分別固器夾具上，因自制模具較細(xì)小，可在咬合處加用磨砂紙增加摩擦力（圖電腦控制系統(tǒng)上將荷載及初始位移位置的讀數(shù)歸零；具兩端用儀器配送扳手旋緊，確保拉伸過程中被測樣本不會出現(xiàn)滑脫制操作系統(tǒng)開始測量后，系統(tǒng)將開始運(yùn)行并自動記錄運(yùn)行過程中的實值；動脈環(huán)斷裂后，系統(tǒng)將繼續(xù)運(yùn)行，移動至預(yù)設(shè)位移處自動停止。鼠主動脈管壁形態(tài)學(xué)測量驗中小鼠主動脈管壁厚度 T0 及小鼠主動脈管壁周長計算方法：通過
miR-22 對主動脈夾層發(fā)生和管壁生物力學(xué)性結(jié)果-22 在人主動脈夾層組織樣本中顯著下主動脈夾層 miRNA 差異表達(dá)的芯片結(jié)果，我s，并利用收集的主動脈夾層患者及正常捐獻(xiàn)者 RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，最后進(jìn)行 RealtimeiR-491-3p、miR-1284、miR-30a、miR-130a 在人R 實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與正常主動脈組織相比，調(diào)（P<0.05），而 miR-491-3p、miR-1284、mi
文應(yīng)的 miR-22 干預(yù)劑，繼續(xù)喂養(yǎng)一周后，除空組皮下植泵血管緊張素Ⅱ。脈 miR-22 干預(yù)效果驗證靜脈注射 miR-22 干預(yù)劑（agomir-22/antagom影響，小鼠尾靜脈注射一周后處死小鼠，取小PCR 驗證。圖 3 表明，agomir -22 組與 agomir-N差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而 anta，可顯著下調(diào)小鼠主動脈 miR-22 的表達(dá)，差agomir/antagomir 干預(yù)方法有效。
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本文編號：
2848778
