第一部分氧化三甲胺對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子凝血途徑的影響目的:觀察氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因子及組織因子途徑抑制物的影響方法:采用CCK-8法評(píng)價(jià)TMAO對(duì)原代內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TF及TFPI的表達(dá);Western blot測(cè)定TF抗原及TFPI抗原水平;發(fā)色底物法檢測(cè)TF的活性水平。結(jié)果:在0-400μM的濃度范圍內(nèi),TMAO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的存活無(wú)明顯影響;TMAO促進(jìn)TF m RNA、TF抗原的表達(dá),并呈劑量及時(shí)間依賴性,分別在400μM TMAO作用后4h及8h達(dá)高峰;TMAO能增強(qiáng)TF的促凝活性;TMAO對(duì)TFPI m RNA及抗原表達(dá)無(wú)明顯影響。結(jié)論:TMAO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)有誘導(dǎo)作用,對(duì)TFPI的表達(dá)無(wú)明顯影響。第二部分氧化三甲胺調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)的機(jī)制研究目的:進(jìn)一步探討TMAO能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制方法:原代細(xì)胞培養(yǎng)采用ECM培養(yǎng)基;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TF mRNA水平;Western blot測(cè)定NF-κB、MAPK p38、ERK、JNK、c-jun的蛋白磷酸化水平;免疫熒光法檢測(cè)NF-κB在細(xì)胞內(nèi)的定位;發(fā)色底物法檢測(cè)TF的活性水平。結(jié)果:TMAO使IκB-α含量減少,使NF-κB p65、c-jun、MAPK p38、ERK、JNK磷酸化水平增多;TMAO使NF-κB p65發(fā)生由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)位;TMAO對(duì)TF m RNA及活性的誘導(dǎo)效應(yīng)可以被NF-κB及c-jun抑制劑逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及c-jun介導(dǎo)了TMAO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)的誘導(dǎo)作用,并可能受到上游MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。第三部分氧化三甲胺對(duì)小鼠深靜脈血栓形成的作用研究目的:觀察血漿高TMAO水平對(duì)小鼠靜脈血栓形成的直接影響方法:分別使用高膽堿飼料及基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠8周,高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)檢測(cè)小鼠血漿TMAO水平;剪尾法對(duì)小鼠出血時(shí)間進(jìn)行測(cè)定;ELISA法檢測(cè)小鼠血漿凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(thrombin-antithrombin complex,TAT)水平;下腔靜脈狹窄法評(píng)估小鼠血栓形成能力。結(jié)果:以不同飼料喂養(yǎng)8周后,高膽堿組小鼠與對(duì)照組小鼠血漿TMAO水平分別為21.40±2.65μM及3.04±0.77μM,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001),而小鼠體重、肝腎功能、血糖、血脂等指標(biāo)無(wú)明顯差異;與正常飲食的小鼠相比,高膽堿飲食使小鼠出血時(shí)間輕微縮短,血漿TAT水平升高,且下腔靜脈結(jié)扎法形成的靜脈血栓模型中形成的血栓較大。結(jié)論:高膽堿飲食造成的血漿TMAO水平升高能在一定程度上激活體內(nèi)凝血過(guò)程,對(duì)靜脈血栓的形成具有促進(jìn)作用。第四部分氧化三甲胺與靜脈血栓形成的關(guān)聯(lián)研究目的:研究血漿TMAO水平及FMO3基因多態(tài)性與靜脈血栓形成的關(guān)聯(lián)方法:建立靜脈血栓組及健康體檢組的生物樣本庫(kù);LC/MS法對(duì)兩組人群血漿TMAO含量進(jìn)行測(cè)定;競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)技術(shù)對(duì)TMAO的代謝酶FMO3編碼基因上的rs1736557、rs2266782、rs2266780三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。結(jié)果:LC/MS法檢測(cè)靜脈血栓組與對(duì)照組血漿TMAO濃度分別為:8.77±4.81μg/L及6.50±4.07μg/L,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.026);KASP技術(shù)對(duì)rs1736557、rs2266782、rs2266780的檢出率分別為96.75%、98%、97.75%,rs2266782、rs2266780多態(tài)性與靜脈血栓形成無(wú)明顯相關(guān)性;rs1736557中A等位基因是靜脈血栓形成的保護(hù)性因素,在加性模型及隱性模型中,OR值分別為0.32(95%CI 0.11-0.92,p=0.027)及0.34(95%0.12-0.96,p=0.033)。結(jié)論:血漿TMAO升高可能是靜脈血栓形成的危險(xiǎn)因素;FMO3基因rs1736557位點(diǎn)A等位基因是靜脈血栓形成的保護(hù)性因素,該結(jié)論有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R543.6
【部分圖文】：

計(jì)量資料符合正態(tài)分布且滿足方t）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，符合正態(tài)分布而方差不齊的計(jì)hitney U test)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。所有統(tǒng)計(jì)分析都統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α 設(shè)結(jié) 果活率的影響評(píng)價(jià) TMAO 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性，根據(jù)各組吸性，結(jié)果如下圖 1 所示，在 0-400μM 的濃不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05，n=4）。

圖 2.定量 PCR 熔解曲線2.1 不同濃度 TMAO 對(duì) HUVEC 表達(dá) TF mRNA 水平的影響如圖 2.1 所示�？梢娛躎MAO 的刺激時(shí)，細(xì)胞 TF mRNA 水平有所升高，且升高的水平具有濃度依賴性，100μM 的濃度開始，TMAO 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞 TF mRNA 表達(dá)的促進(jìn)作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異400μM 的 TMAO 表現(xiàn)出的刺激作用最強(qiáng)，約是基礎(chǔ)水平的 1.84 倍，效果與 1g/ml LPS 的刺激作用相當(dāng)。以 400μM 的 TMAO 濃度作用于 HUVEC 細(xì)胞，TF mRNA 水從作用后 1h 開始升高，4h 時(shí)達(dá)峰值，隨后開始下降但仍較基礎(chǔ)表達(dá)高。這種促進(jìn)用可維持 24h。各時(shí)間點(diǎn) TF mRNA 水平與基礎(chǔ)水平的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.0

a. 不同濃度 TMAO 對(duì) TF mRNA 的影響，與對(duì)照組相比，*p<0.0MAO 作用不同時(shí)間對(duì) TF mRNA 的影響, 與對(duì)照組相比，*p<0.
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2839699