第一部分免疫性血小板減少癥患者血漿中PGRN水平的檢測(cè)研究背景:免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia,ITP)是臨床上比較常見(jiàn)的一種自身免疫性的出血性疾病。ITP的發(fā)生主要是由于患者對(duì)于自身的血小板抗原的免疫失耐受,產(chǎn)生了免疫介導(dǎo)的血小板過(guò)度破壞和/或生成的不足,最終導(dǎo)致血小板的減少。臨床上的表現(xiàn)多以皮膚黏膜出血為主,嚴(yán)重的患者也可有內(nèi)臟出血、顱內(nèi)出血等,威脅患者的生命安全。關(guān)于ITP發(fā)病機(jī)制以及臨床治療的研究一直都是血液病領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)之一。ITP的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,具體機(jī)制仍然不明確。眾多研究證實(shí),特異性抗血小板抗體介導(dǎo)的血小板過(guò)度破壞以及T細(xì)胞功能異常,例如Th1/Th2細(xì)胞比例的失衡、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的減弱以及功能強(qiáng)化的CD8+T淋巴細(xì)胞(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)等,在ITP發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。此外,越來(lái)越多的免疫調(diào)控分子也被證實(shí)參與了 ITP的病理生理過(guò)程。充分發(fā)掘參與ITP的調(diào)節(jié)分子及調(diào)控機(jī)制,對(duì)于改善ITP的治療策略、提高ITP患者的治療水平具有重要意義。顆粒蛋白前體(progranulin,PGRN)是一種自分泌的生長(zhǎng)因子,它是由593個(gè)氨基酸所組成。PGRN在人體多種類(lèi)型的細(xì)胞中表達(dá)廣泛,比如造血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、T細(xì)胞等等。PGRN參與人體多種生理病理反應(yīng),有不同的生物學(xué)功能,與腫瘤、炎癥、額顳葉癡呆等疾病有著密切的關(guān)系。近年來(lái),PGRN在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮的調(diào)節(jié)功能日益受到重視,例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎等。在調(diào)控機(jī)制方面,PGRN主要通過(guò)與腫瘤壞死因子α(umor necrosis factor-α,TNFα)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合腫瘤壞死因子受體(umor necrosis factor receptors,TNFRs),從而抑制了 TNFα所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。另外,PGRN能夠在體外刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory t cells,Treg)的增殖,并減輕TNFα對(duì)其的抑制作用。如前文所示,Treg在ITP的發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用,作為重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,Treg抑制多種免疫細(xì)胞的活性,來(lái)維持自身的免疫耐受,預(yù)防諸如ITP之類(lèi)的自身免疫性疾病的發(fā)生,而在ITP病人中Treg的數(shù)量減少、功能減弱,使得自身活化的B細(xì)胞或Th細(xì)胞逃脫了 Treg的監(jiān)管,不斷活化并產(chǎn)生自身抗血小板的抗體,并加強(qiáng)了單核巨噬系統(tǒng)對(duì)血小板的破壞,成為ITP發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制。因此我們推測(cè),PGRN可能也參與ITP的發(fā)病過(guò)程之中。而作為一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)分子,PGRN在ITP中的作用一直未得證實(shí)。在本研究中,我們對(duì)PGRN在ITP病理生理過(guò)程中的作用進(jìn)行了初步探索。我們首先檢測(cè)了 ITP患者、非免疫性血小板減少的患者以及正常人血漿中PGRN的表達(dá)水平。通過(guò)進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,初步明確了 PGRN在ITP病理生理過(guò)程中的作用,為深入探索其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。目的:PGRN是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子,并在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮作用。ITP是臨床常見(jiàn)的一種自身免疫性的出血性疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,且缺少敏感并獨(dú)特的檢測(cè)標(biāo)志。本研究旨在明確PGRN是否在ITP發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,并進(jìn)一步對(duì)其參與機(jī)制進(jìn)行初步探討,以期提高對(duì)ITP發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。方法:1、選取52例ITP的患者(包括22名初診患者及30名復(fù)發(fā)患者)、13例非免疫性血小板減少的患者及40例正常人志愿者的外周血,利用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)其血小板計(jì)數(shù),并留血漿備用。2、利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa)檢測(cè)上述血漿標(biāo)本中PGRN的水平。另外,利用該試驗(yàn)對(duì)19名ITP患者治療后血漿中PGRN的水平進(jìn)行了檢測(cè)。3、利用Mann-Whitneytest,分別統(tǒng)計(jì)分析了 ITP患者與非免疫性血小板減少的患者及正常人血漿中PGRN水平的差異。同法,統(tǒng)計(jì)分析了 ITP初診患者與復(fù)發(fā)患者血漿中PGRN水平的差異,以及非免疫性血小板減少患者的血漿中PGRN水平與正常人的差異。另外,利用Wilcoxon matched-pairs test,分別統(tǒng)計(jì)分析了 ITP初診患者或復(fù)發(fā)患者治療前后血漿中PGRN水平的差異。利用Spearman correlation analysis,統(tǒng)計(jì)分析了 ITP患者血漿中PGRN的表達(dá)水平與外周血血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性。p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、ITP初診患者或復(fù)發(fā)患者血漿中PGRN水平均明顯高于正常人及非免疫性血小板減少患者(初診ITP患者43.79 ± 9.07 ng/mLvs.正常人20.51 ± 1.38 ng/mL,p0.05;ITP 復(fù)發(fā)患者 42.04 ± 4.81 ng/mL vs.正常人 20.51 ±1.38 ng/mL,p0.01;初診 ITP 患者 43.79 ± 9.07 ng/mL vs.非免疫性血小板減少患者 19.24 ± 2.63 ng/mL,pp0.05;ITP 復(fù)發(fā)患者 42.04 ± 4.81 ng/mLvs.非免疫性血小板減少患者19.24 ± 2.63 ng/mL,pp0.05)。2、ITP初診患者與復(fù)發(fā)患者相比,血漿中PGRN水平無(wú)明顯差別(p0.05);非免疫性血小板減少患者的血漿中PGRN水平與正常人也無(wú)明顯差別(p0.05)。3、經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后,ITP初診患者及復(fù)發(fā)患者血漿中PGRN的水平均發(fā)生顯著下降(初診患者治療前后,66.48 ± 18.02 ng/mLvs.44.09 ± 14.45 ng/mL,pp0.05;復(fù)發(fā)患者治療前后,64.32 ± 7.262 ng/mL vs.43.28 ±7.797 ng/mL,,p0.01)。4、ITP患者血漿中PGRN的表達(dá)水平與患者血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(= 0.011,r =-0.350)。結(jié)論:1、與正常人及非免疫性血小板減少的患者相比,ITP患者血漿中PGRN水平顯著升高,提示PGRN可能參與調(diào)節(jié)ITP的疾病進(jìn)程,并且PGRN有望成為鑒別免疫性及非免疫性血小板減少癥的新型臨床檢測(cè)指標(biāo)。2、經(jīng)治療后,ITP患者血漿中PGRN的水平顯著下降,進(jìn)一步提示了 PGRN在ITP中的潛在調(diào)節(jié)功能。3、ITP患者血漿中PGRN水平與其外周血中血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān),同樣提示了PGRN可能參與調(diào)控ITP的病理生理過(guò)程。第二部分PGRN在ITP動(dòng)物模型中的作用及機(jī)制研究研究背景:ITP是一種以血小板減少為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病,目前診斷方法仍以排除性診斷為主。ITP的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,目前認(rèn)為主要的發(fā)病機(jī)制是體液免疫和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的血小板破壞增多,以及血小板生成不足。眾多免疫調(diào)節(jié)因子在ITP的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著作用。在前期研究中,通過(guò)對(duì)ITP、非免疫性血小板減少患者及正常人的外周血標(biāo)本的檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,我們初步證實(shí)了具有免疫調(diào)節(jié)功能的PGRN很可能參與了 ITP發(fā)病機(jī)制的調(diào)控。接下來(lái),我們將利用ITP動(dòng)物模型(包括被動(dòng)模型和主動(dòng)模型),進(jìn)一步明確PGRN在ITP中的作用,并初步探討其作用機(jī)制。ITP動(dòng)物模型對(duì)于研究ITP的發(fā)病以及治療有著重要的作用,近年來(lái)有多種模擬ITP臨床病理特征的動(dòng)物模型被建立。早期有單純利用射線(xiàn)照射或者注射有骨髓抑制作用的化學(xué)藥物來(lái)導(dǎo)致血小板減少的動(dòng)物模型,但是這些模型只能通過(guò)短暫的骨髓抑制作用來(lái)減少血小板的生成,并且可能產(chǎn)生化療后骨髓損傷或者再生障礙性貧血等并發(fā)癥,并不能很好的模擬ITP的致病過(guò)程。近年來(lái)被廣泛接受并使用的有被動(dòng)模型和主動(dòng)模型兩種。被動(dòng)模型是通過(guò)人工免疫的方法來(lái)得到ITP模型,即向小鼠注射外源性的抗原或者抗體(例如外源性血小板、抗血小板血清、抗血小板單克隆抗體等),導(dǎo)致其血小板下降。這種動(dòng)物模型的優(yōu)勢(shì)是操作相對(duì)簡(jiǎn)單,對(duì)于研究藥物治療效果的觀(guān)察比較快速有效,缺點(diǎn)是持續(xù)時(shí)間較短,僅能模擬臨床病理結(jié)果,并不能完全反應(yīng)ITP復(fù)雜的致病機(jī)制。主動(dòng)模型主要是由Chow等人發(fā)明改良的同時(shí)利用野生小鼠、CD61基因敲除鼠以及重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠,制造出能夠產(chǎn)生自發(fā)免疫的ITP的動(dòng)物模型,能夠更好的反應(yīng)出ITP的臨床特征和模擬發(fā)病過(guò)程。ITP致病機(jī)制復(fù)雜,每種動(dòng)物模型并不能十分完美的模擬出與人體一樣的生理病理過(guò)程,但是動(dòng)物模型的建立與研究對(duì)ITP的發(fā)病及治療的探索都是十分有效與重要的,本研究建立了兩種不同的ITP動(dòng)物模型,并首次在造模過(guò)程中引入了 PGRN基因敲除鼠,探究了 PGRN在ITP中的作用以及可能的機(jī)制。目的:利用PGRN基因敲除鼠,構(gòu)建兩種ITP動(dòng)物模型,并研究了 PGRN對(duì)ITP動(dòng)物模型血小板計(jì)數(shù)的影響,以明確PGRN在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用,探討其作為ITP治療藥物的可能性。同時(shí),以ITP動(dòng)物模型為基礎(chǔ),初步探索PGRN參與調(diào)控ITP病理生理過(guò)程的潛在分子機(jī)制。方法:1、建立ITP被動(dòng)小鼠模型。主要方法為:選取體重相近,6-8周的雌性C57BL/6J野生型小鼠(n = 6)以及PGRN基因敲除鼠(Grn-/-,n = 6),通過(guò)大隱靜脈采血的方法,檢測(cè)兩組動(dòng)物的外周血血小板的計(jì)數(shù)作為基礎(chǔ)水平。為兩組動(dòng)物腹腔注射大鼠抗小鼠血小板CD41抗體(5 μg/只),并在注射后3、24、48、72小時(shí)檢測(cè)兩組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù),利用Mann-Whitney test統(tǒng)計(jì)分析兩組動(dòng)物血小板計(jì)數(shù)在上述各時(shí)間點(diǎn)的差異。2、為Grn-/小鼠腹腔注射大鼠抗小鼠血小板CD41抗體(5μg/只)以建立ITP被動(dòng)小鼠模型,并小鼠隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組(n = 5)腹腔注射加有50μg PGRN 的 100 μL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS),對(duì)照組(n = 5)只給予相同體積的PBS溶液,并在注射CD41抗體后的3、24、48、72小時(shí),分別檢測(cè)兩組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù),利用Mann-Whitney test統(tǒng)計(jì)分析兩組動(dòng)物血小板計(jì)數(shù)在上述各時(shí)間點(diǎn)的差異。3、選取6-8周并體重相近的C57BL/6J野生型小鼠(n = 6)以及Grn-/-小鼠(n =6),并為動(dòng)物腹腔注射大鼠抗小鼠血小板CD41抗體(5 μg/只)。在注射前或者注射24小時(shí)后分別取出各組動(dòng)物脾臟,提取脾細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例,利用Mann-Whitney test統(tǒng)計(jì)分析兩組動(dòng)物間脾細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例的差異。4、建立ITP主動(dòng)小鼠模型。主要方法為:將野生C57BL/6J小鼠的血小板通過(guò)尾靜脈注射的方法,注入CD61基因敲除小鼠體內(nèi),每次注射約108個(gè)血小板,連續(xù)四周。CD61基因敲除小鼠血漿抗血小板抗體滴度達(dá)標(biāo)后,取CD61基因敲除鼠的脾臟,分離成單個(gè)細(xì)胞,取5×104個(gè)脾細(xì)胞經(jīng)腹腔注射至提前接受全身200 cGy射線(xiàn)處理的SCID小鼠中,即建立了 ITP主動(dòng)小鼠模型。在隨機(jī)分組的兩組ITP主動(dòng)小鼠模型中(n = 8),每三天分別給予腹腔注射50μg的PGRN或者PBS,在第7、14、21、28天檢測(cè)兩組小鼠血小板的計(jì)數(shù),并用Mann-Whitney test統(tǒng)計(jì)分析兩組動(dòng)物間血小板計(jì)數(shù)的差異。結(jié)果:1、利用C57BL/6J野生型小鼠及Grn-/-小鼠構(gòu)建ITP被動(dòng)模型,在腹腔注射大鼠抗小鼠CD41抗體后的3小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí),PGRN敲除鼠外周血血小板計(jì)數(shù)的下降程度均顯著高于野生型小鼠(3 h,p0.05;24 h,p0.01;48 h,p0.05;72 h,p0.01)。2、利用Grn-/-小鼠構(gòu)建ITP被動(dòng)模型,在對(duì)兩組小鼠分別注射PGRN或PBS后24小時(shí)及48小時(shí),注射PGRN組小鼠的外周血血小板計(jì)數(shù)均顯著高于PBS組(P均小于0.05)。3、利用C57BL/6J野生型小鼠及Grn-/-小鼠構(gòu)建ITP被動(dòng)模型前,兩組小鼠脾細(xì)胞中Treg比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);腹腔注射大鼠抗小鼠CD41抗體24小時(shí)后,Grn-/-小鼠脾細(xì)胞中Treg比例顯著低于野生小鼠組(p0.05)。4、ITP主動(dòng)小鼠模型中,注射PGRN的小鼠組在第7、14、21天時(shí)血小板下降的程度顯著低于僅注射PBS的對(duì)照組小鼠(7 d,p0.05;14 d,p0.01;21 d,p0.05)。結(jié)論:在ITP被動(dòng)模型及主動(dòng)模型中,PGRN均具有促進(jìn)血小板升高的作用,進(jìn)一步證實(shí)了 PGRN在ITP中具有保護(hù)性調(diào)控作用。并且,通過(guò)對(duì)野生型小鼠及PGRN基因敲除鼠構(gòu)建的ITP被動(dòng)模型脾臟細(xì)胞中Treg比例的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了 PGRN基因的缺失會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物脾臟細(xì)胞中Treg比例的下降,這提示了 PGRN可能通過(guò)調(diào)控Treg細(xì)胞數(shù)目來(lái)參與ITP的病理生理過(guò)程。以上研究結(jié)果,證實(shí)了 PGRN在ITP發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用,初步揭示了其調(diào)控機(jī)制,為今后更加深入的機(jī)制探索奠定了基礎(chǔ),也為ITP的治療提供了新的候選藥物及思路。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R558.2
【部分圖文】：

圖１調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞抑制ＩＴＰ中的致病性免疫細(xì)胞［１２］??顆粒蛋白前體（ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ，?ＰＧＲＮ）是一種自分泌型的生長(zhǎng)因子，廣泛表達(dá)??于多種細(xì)胞和組織，例如造血干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、骨骼、軟骨、上皮細(xì)胞、神經(jīng)??細(xì)胞等等。ＰＧＲＮ是一種重要的生長(zhǎng)因子，具有多種生物學(xué)功能，參與早期胚胎??、、１３。，ＰＧＲＮ

?附圖??附圖１．??，??，??６０－ｉ?１?１］?ｊ???ｉ：ｎｉｓｉ｜??。丨?ｉ．?ｉ?ｉｌｌ?＿?■??、人〇、?＜＜？?＜５??。Ｗ?／?／??圖１：?ＩＴＰ患者、非免疫性血小板減少患者及正常對(duì)照間血漿中ＰＧＲＮ的含量??對(duì)比。??ＩＴＰ初診或復(fù)發(fā)患者血漿中ＰＧＲＮ的含量均顯著高于非免疫性血小板減少的患者??以及正常人對(duì)照（結(jié)果分別為，初診ＩＴＰ患者４３．７９?士?９．０７?ｎｇ／ｍＬ?ｖｓ．正常人２０．５１??±?１．３８?ｎｇ／ｍＬ，?ｐ?＜?０．０５；初診?ＩＴＰ?患者?４３．７９?±?９．０７?ｎｇ／ｍＬ?ｖｓ？非免疫性血小板減??少患者?１９．２４?±?２．６３?ｎｇ／ｍＬ，ｐ＜?０．０５；?ＩＴＰ?復(fù)發(fā)患者?４２．０４?±?４．８１?ｎｇ／ｍＬｖｓ．正??常人?２０．５１?±?１．３８ｎｇ／ｍＬ，ｐ＜０．０１；ＩＴＰ?復(fù)發(fā)患者?４２．０４?土?４．８１ｎｇ／ｍＬｖｓ．非免??疫性血小板減少患者１９．２４?±?２．６３?ｎｇ／ｍＬ，ｐ＜?０．０５）。然而，１ＴＰ初診患者和復(fù)??發(fā)患者之間血漿ＰＧＲＮ的含量無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ｐ＜?０．０５）

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2838050