背景:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)發(fā)生的原因是冠狀動(dòng)脈急性閉塞,其具有突發(fā)性,病死率高、預(yù)后差等特點(diǎn)。梗死后缺血區(qū)血流灌注的恢復(fù)與患者預(yù)后情況密切相關(guān),而血管新生、側(cè)枝循環(huán)形成是心肌梗死后修復(fù)的重要途徑,針對(duì)血管新生的治療可以改善患者預(yù)后情況。內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和小管形成在血管新生過程中至關(guān)重要,血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial cell growth factor,VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子、血管生成素等均可促進(jìn)血管新生,該過程受到多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控。有文獻(xiàn)報(bào)道,AMPK激活可引起p38MAPK磷酸化,增加VEGF mRNA穩(wěn)定性及蛋白分泌,進(jìn)而促進(jìn)血管新生;另外,AMPK激活也可抑制糖氧剝奪引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡。由此可見,AMPK活性與內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管新生密切相關(guān)。維生素B6(Vitamin B6,VitB6)在人體內(nèi)常作為輔酶,參與多種代謝反應(yīng),例如糖異生及活性氧簇的清除,其缺乏可引起一些慢性疾病。有文獻(xiàn)報(bào)道,長期VitB6缺乏者心血管事件發(fā)生率更高,預(yù)后更差,但其潛在機(jī)制仍未可知。也有文獻(xiàn)報(bào)道,血循環(huán)VitB6低水平與C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)水平增高相關(guān),而CRP水平可反應(yīng)冠心病預(yù)后情況。另外VitB6可使炎癥因子被快速清除,而在各種心血管事件中,均存在炎癥過度激活。此前有文獻(xiàn)報(bào)道,AMPK可通過激活A(yù)P-2α抑制NF-κb的活性,發(fā)揮抑制炎癥的作用。因此,我們推測,充足的VitB6供給可通過激活A(yù)MPK抑制過度激活的炎癥,上調(diào)心肌梗死后的血管新生,進(jìn)而促進(jìn)心肌梗死后的心功能恢復(fù),改善預(yù)后情況。研究目的:1.研究VitB6是否可以激活A(yù)MPK;2.研究VitB6是否可以在體內(nèi)體外改善HUVECs功能并促進(jìn)血管新生;3.補(bǔ)充VitB6能否促進(jìn)心肌梗死小鼠心功能恢復(fù)。研究內(nèi)容及方法:1.不同濃度梯度及時(shí)間梯度VitB6刺激HUVECs,確定VitB6處理細(xì)胞的最適濃度及時(shí)間。2.檢測VitB6處理后,HUVECs的AMPK磷酸化水平的改變。3.觀察VitB6處理對(duì)HUVECs遷移功能的影響,HUVECs的遷移活力通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估。4.觀察VitB6干預(yù)對(duì)HUVECs增殖功能的影響,通過CCK-8和MTT試劑盒檢測細(xì)胞增殖活力。5.觀察VitB6處理對(duì)HUVECs小管形成功能的影響。6.Compound.C預(yù)處理抑制AMPK磷酸化后,觀察VitB6對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響是否繼續(xù)存在。7.動(dòng)物分組及模型建立:8周齡大的b129小鼠,隨機(jī)分為2組,干預(yù)組給予2 mg/ml的VitB6飲水,14周后,所有小鼠采用高爾和手術(shù)法行左前降支結(jié)扎術(shù),構(gòu)建急性心肌梗死模型。8.小動(dòng)物心臟超聲:在心肌梗死后2周,使用小動(dòng)物心臟超聲評(píng)估小鼠梗死后心功能,通過超聲心動(dòng)圖系統(tǒng)計(jì)算收縮或舒張的左心室內(nèi)徑(Left ventricular internal diameter at end-systole or end-diastole,LVIDs或LVIDd)、左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction,LVEF)和短軸縮短率(Fraction shortening,FS)。9.組織病理學(xué)染色:HE染色評(píng)估心肌梗死面積大小;梗死交界區(qū)CD31及α-SMA免疫組化評(píng)估新生血管密度。10.應(yīng)用多因子檢測試劑盒檢測各組小鼠心肌梗死后2周血清炎癥因子水平。11.蛋白免疫印跡(Western blot,WB)檢測梗死區(qū)域心肌組織中AMPK活性和血管新生標(biāo)志物水平。結(jié)果:1.0.5 mM的刺激濃度和24小時(shí)的刺激時(shí)間為VitB6作用于細(xì)胞的最適條件,該條件下,HUVECs的AMPK磷酸化程度最高。2.0.5 mM及1.0 mM VitB6刺激24小時(shí)后,HUVECs的遷移功能得到改善;3.0.5mM及1.0mM VitB6干預(yù)24小時(shí)后,CCK-8和MTT均未檢測到細(xì)胞增殖能力的變化;4.0.5 mM及1.0 mM VitB6刺激24小時(shí)后,HUVECs小管形成能力增強(qiáng)。5.VitB6刺激可使細(xì)胞的VEGFA表達(dá)水平升高。6.AMPK抑制劑Compound.C預(yù)處理HUVECs后,VitB6刺激不引起AMPK磷酸化水平改變,同時(shí)對(duì)VEGFA的促進(jìn)作用消失。7.Compound.C預(yù)處理可消除VitB6對(duì)細(xì)胞遷移及小管形成功能的促進(jìn)作用。8.預(yù)先給予2 mg/ml的VitB6飲水,可減小小鼠心肌梗死面積百分比。9.預(yù)先VitB6干預(yù)后,小鼠心肌梗死后心功能較對(duì)照組改善,LVEF和FS均增加,而LVIDd和LVIDs較對(duì)照組小。10.預(yù)先VitB6干預(yù)后,小鼠心肌梗死與非梗死交界區(qū)新生血管密度較對(duì)照組增加。11.心肌梗死小鼠血清TNF-α水平和IL-6水平較對(duì)照組升高,VitB6干預(yù)可削弱該變化。12.VitB6干預(yù)組小鼠梗死區(qū)心肌組織蛋白中,AMPK磷酸化程度及VEGFA水平均較對(duì)照組升高。結(jié)論:1.VitB6在體內(nèi)和體外均可激活A(yù)MPK;2.VitB6可改善HUVECs的遷移和成管功能,且該作用與激活A(yù)MPK相關(guān);3.補(bǔ)充VitB6可促進(jìn)小鼠心肌梗死后心功能恢復(fù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

ＶｉｔＢ６在ＨＵＶＥＣｓ中激活ＡＭＰＫ〇不同濃度的ＶｉｔＢ６朿ｌｊ激ＨＵＶＥＣＭＰＫ激活情況，０．５－１．０ｍＭ為最適濃度。ＡＶｉｔＢ６作用于ＨＵＶＥＭＰＫａ及總ＡＭＰＫａ的ＷＢ條帶；Ｂ應(yīng)用Ｉｍａｇｅ?Ｊ對(duì)Ａ圖灰度值的分。（＊?＼／ｓ．Ｏ?ｍＭ?組，Ｐ?＜０．０５；?＊＊?＼／ｓ．Ｏ?ｍＭ?組，Ｐ?＜０．０１；?＊林?ｖｓ．Ｏ?．００１）??

?ＶｉｔＢ６促進(jìn)ＨＵＶＥＣｓ小管形成功能。０．５?ｍＭ和１．０?ｍＭ?ＶｉｔＢ６干預(yù)２４小??時(shí)后，將細(xì)胞收集并接種于Ｍａｔｒｉｇｅｌ膠，觀察ＨＵＶＥＣｓ小管形成能力，ＶｉｔＢ６??處理組小管形成能力增加。Ａ不同濃度ＶｉｔＢ６刺激２４小時(shí)后細(xì)胞第６小時(shí)小管??形成情況，圖為５次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性圖片，上半部分放大倍數(shù)為４〇ｘ，下半部??分放大倍數(shù)為１〇〇ｘ；?Ｂ?Ｉｍａｇｅ」分析后每低倍視野的小管形成節(jié)點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)分??析；Ｃ每低倍視野總節(jié)段長度的統(tǒng)計(jì)分析。（＊ｖｓ．?Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｐ＜０．０５）??

?ＶｉｔＢ６對(duì)ＨＵＶＥＣｓ增殖功能無明顯影響。０．?５?ｍＭ和１．?０?ｍＭ?ＶｉｔＢ６干預(yù)ＨＵＶＥＣｓ??２４ｈ后，應(yīng)用ＣＣＫ－８及ＭＴＴ檢測細(xì)胞活力，ＶｉｔＢ６處理組增殖能力無明顯變化。Ａ??不同濃度ＶｉｔＢ６刺激ＨＵＶＥＣｓ后ＣＣＫ－８檢測細(xì)胞增殖能力的統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組設(shè)定為??１，三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Ｂ不同濃度ＶＵＢ６刺激ＨＵＶＥＣｓ后ＭＴＴ檢測細(xì)胞增殖??能力的統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組設(shè)定為１，三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。??
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本文編號(hào)：2836831