研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)居高不下的患病率及其多種相關并發(fā)癥,嚴重威脅人類的身心健康。糖尿病性心肌損傷(diabetic myocardialinjury,DMI)作為DM的主要心血管并發(fā)癥之一,指即使不伴有冠狀動脈硬化或高血壓等其它心血管疾病,心臟在持續(xù)高糖的環(huán)境下仍可出現(xiàn)一系列心肌結構損傷及功能異常,并最終引發(fā)心力衰竭、心律失常、猝死,致殘和致死率極高。DMI致病過程中的相關分子機制極為復雜,信號通路眾多,尚未被詳盡闡明。氧連-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修飾是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾,廣泛參與調(diào)控細胞內(nèi)多種病理生理過程。同時,自噬作為細胞內(nèi)一種程序性死亡,由自噬體的形成、膜的延伸以及自噬溶酶體降解等多個環(huán)節(jié)組成,其整個過程又被稱之為自噬流,對維持細胞自身穩(wěn)態(tài)具有重要意義。雖然O-GlcNAc修飾與自噬均分別被證實與DMI的發(fā)生有密切關系,但對于兩者在DMI中的關聯(lián)機制知之甚少。新近研究顯示,在果蠅、線蟲等多種生物模型中,膜突觸相關蛋白SNAP 29可與STX17,VAMP8形成復合物影響自噬流的過程,同時SNAP29可作為底物蛋白被O-GlcNAc修飾。我們前期研究發(fā)現(xiàn),鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的DMI大鼠模型中O-GlcNAc糖基化水平升高,并伴有自噬流的抑制。然而,在哺乳動物DM疾病模型中,O-GlcNAc修飾SNAP29是否參與調(diào)控自噬流以及其具體分子機制的研究未見報道。研究目的:既往研究提示,蛋白SNAP29既可參與自噬過程,也可被O-GlcNAc修飾,是解析O-GlcNAc修飾與自噬關聯(lián)機制的紐帶。O-GlcNAc修飾、自噬及DMI三者之間的相互關聯(lián)啟發(fā)我們研究探索:O-GlcNAc修飾SNAP29是否通過調(diào)控自噬流參與DMI的致病過程?為此,我們通過在體動物和離體細胞實驗揭示O-GlcNAc糖基化修飾SNAP29通過調(diào)控自噬流參與DMI的發(fā)生及發(fā)展,并探討其潛在的分子機制以及作用的具體環(huán)節(jié),為將來DMI的臨床治療提供了可能的新靶點與機遇。研究方法:在體動物實驗將大鼠分為四組:對照組(Vehicle)、糖尿病+生理鹽水組(STZ+Nacl)、糖尿病+O-GlcNAc糖基化抑制劑組(STZ+6-Diazo-5-oxo-L-norleucine,STZ+Don)以及糖尿病+O-GlcNAc糖基化激動劑組(STZ+Thiamet G,STZ+TG)。本研究動物實驗所采用實驗方法包括:血糖和體重測定、超聲心動圖(Vevo2100)、Western-Blot、免疫共沉淀、組織學蘇木-伊紅(HemotoxylinEosin,HE)染色、馬松(Masson)染色、透射電子顯微鏡等。細胞實驗所采用實驗方法包括:原代乳鼠心肌細胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs)分離和培養(yǎng)、高糖(Glu:25 mM/L)處理、Western-Blot、免疫共沉淀、腺病毒載體構建和質(zhì)粒的分離純化及透射電子顯微鏡等。離體細胞實驗分為:正常糖濃度處理組(normal glucose,Vehicle)、高糖濃度處理組(high glucose,Glu)、正常糖+O-GlcNAc糖基化激動劑組(TG)、高糖+O-GlcNAc糖基化激動劑組(Glu+TG)、正常糖+O-GlcNAc糖基化抑制劑組(Don)和高糖+O-GlcNAc糖基化抑制劑組(Glu+Don),以及基因轉(zhuǎn)染技術干預后的正常糖轉(zhuǎn)染對照組(con+sh-ctrl組)、正常糖轉(zhuǎn)染干擾OGT組(con+sh-OGT)、正常糖轉(zhuǎn)染過表達OGA組(con+ad-OGA)、高糖轉(zhuǎn)染對照組(Glu+sh-ctrl)、高糖轉(zhuǎn)染干擾OGT組(Glu+sh-OGT)、高糖轉(zhuǎn)染過表達OGA組(Glu+ad-OGA)。研究結果:1.經(jīng)STZ誘導8周的大鼠(8-week STZ大鼠)呈現(xiàn)典型的Ⅰ型DM表現(xiàn),伴有DMI,心肌O-GlcNAc修飾的增加與自噬流的抑制。結果顯示:8-week STZ組大鼠相比正常對照組(Vehicle組),血糖增高、飲食飲水量增加,體重下降,心臟肥厚(心臟重量/體重比值增加);超聲結果顯示:心臟舒張功能減退(E/A比值明顯下降)及左室質(zhì)量、左室舒張/收縮末容積的明顯增加;組織學檢測結果顯示:心肌排列紊亂、脂肪堆積、纖維增生。8-week STZ大鼠血糖持續(xù)升高的同時,利用Western-Blot檢測到O-GlcNAc修飾水平及其N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(OGT)表達增加,N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)的表達降低;同時檢測自噬相關標記蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ與P62的表達增加,透射電子顯微鏡下可觀察到明顯蓄積的自噬體。2.在體增加O-GlcNAc修飾可加重Ⅰ型DM大鼠心肌損傷并抑制其自噬流。分別給予STZ大鼠O-GlcNAc糖基化修飾激動劑(Thiamet-G,TG)與抑制劑(6-diazo-5-oxo-l-norleucine,Don),結果顯示:TG導致STZ大鼠心肌O-GlcNAc修飾增加,心臟舒張功能惡化(E/A下降或E/A大于2),左室舒張/收縮末容積的明顯增加,心肌排列紊亂、脂肪堆積、纖維增生加重,且自噬流被進一步抑制;而Don可降低O-GlcNAc修飾水平,同時緩解惡化的心臟舒張功能、減少左室舒張/收縮末容積,以及改善心肌異常結構,并使得自噬流順利進行。3.離體增加O-GlcNAc修飾可抑制NRCMs自噬流進行。與在體實驗一致,離體NRCMs經(jīng)高糖刺激后,分別給予TG與Don,結果顯示:TG增加NRCMs O-GlcNAc修飾的同時,LC3Ⅱ/Ⅰ,Beclin1,P62,LAMP2表達水平均增高,自噬流進一步被阻礙;相反,Don則明顯降低O-GlcNAc水平,可促進自噬流進行。利用基因轉(zhuǎn)染技術,同樣證實干擾OGT或過表達OGA均可降低O-GlcNAc修飾,促進自噬流進行。4.高糖抑制自噬流的降解階段。在NRCMs水平,通過干擾LAMP2的表達、給予自噬抑制劑3-MA,分別抑制自噬流的降解及起始階段;高糖水平下,干擾LAMP2不能進一步增加Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平;經(jīng)自噬起始抑制劑3-MA干預,LC3Ⅱ/Ⅰ與P62的表達水平,不同于單純高糖誘導的NRCMs,而出現(xiàn)下降;以上均證實高糖并不影響自噬的起始階段,而是參與抑制自噬的降解階段。5.SNAP29 O-GlcNAc修飾阻礙SNAP29-STX17-VAMP8復合物形成而抑制自噬流的降解階段。采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)檢測到SNAP29的O-GlcNAc修飾可通過負向調(diào)控SANP29-VAMP8-STX17復合物的形成影響自噬流的降解。激動劑TG增加SNAP29的O-GlcNAc修飾,同時減少SNAP29、VAMP8、STX17三者間相互結合;給予抑制劑Don、沉默OGT或過表達OGA可減少SNAP29 O-GlcNAc修飾,而促進SNAP29-VAMP8-STX17三者復合物形成。結論:1.8-week的STZ大鼠具有典型的早期Ⅰ型DMI表現(xiàn):心臟舒張功能減退,左室質(zhì)量、左室舒張/收縮末容積的明顯增加及心肌排列紊亂,脂肪堆積,纖維增生;2.8-week的STZ大鼠中心肌O-GlcNAc修飾增加,自噬流受抑制,DMI加重;3.在體動物與離體細胞實驗一致證實,增加O-GlcNAc修飾水平,自噬流將進一步被抑制;而減少O-GlcNAc修飾,使自噬流恢復順暢;4.高糖影響自噬的具體環(huán)節(jié)是抑制自噬流的降解階段5.首次證實,Ⅰ型DMI中O-GlcNAc修飾抑制自噬流降解階段的具體分子機制是:O-GlcNAc修飾通過阻礙復合物SNAP29-STX17-VAMP8的形成,從而抑制由該復合物介導的自噬流降解的過程。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2;R542.2
【部分圖文】：

前言轉(zhuǎn)移酶(OGT)催化 GlcNAc基團從糖供體 UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)移到受體蛋白或蘇氨酸殘基上，而 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)則催化 GlcNAc 基飾蛋白上解離[30-34]。以上兩種酶的共同作用使 O-GlcNAc 修飾處于動態(tài)態(tài)，同時 OGT 與 OGA 也是 O-GlcNAc 修飾研究的常用靶點[35]。已糖成過程如圖 1 所示。

圖 1.STZ 誘導的大鼠具有典型Ⅰ型 DM 表現(xiàn)飲食飲水增加；1d:STZ 組大鼠體重減輕。所有vs 同周齡 Vehicle 組大鼠；Vehicle 組大鼠:對Water intake:飲食飲水量；Body weight:體重；鼠周齡。

隨周齡的增加， STZ 組大鼠心臟舒張功能明顯減退，E/A 比值a,2c:4-week STZ 大鼠心臟彩超除 E/A 比值有下降外，其余各項參數(shù)與 Vehicle明顯差異（n = 7/組）；2b,2d:8-week STZ 大鼠心臟舒張功能明顯減退，E/A ，左室質(zhì)量與左室舒張/收縮末容積明顯增加。值均為平均值±標準差（n = 0.05 vs Vehicle 組，** P <0.01vs Vehicle 組.。4-week STZ 大鼠:經(jīng) STZ 誘導 4 周；8-week STZ 大鼠:經(jīng) STZ 誘導 8 周的 STZ 組大鼠；Vehicle 組大鼠:對照組大組大鼠的心肌組織結構改變?nèi)鐖D 3a 所示，STZ 組大鼠血糖升高伴有明顯的體重下降（P<0.05 vs 4-week STZ 大鼠的心臟重量（heart weight, HW）/體重（body weight無明顯變化，但隨著周齡推移，8-week STZ 大鼠 HW/BW 比值顯0.05 vs Vehicle 組），提示心臟明顯肥厚。與此同時，通過免疫組化法asson 染色）觀察心肌形態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)與 Vehicle 組相比，4-week ST組織結構無明顯改變?nèi)鐖D 3b,3c,3d,3e，而 8-week STZ 大鼠心肌細胞脂質(zhì)沉積及心肌間纖維化明顯增多如圖 3f,3g,3h,3i。上述結果均提示
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本文編號：2836821