CCDC80下調(diào)血管平滑肌細胞LPL表達對動脈粥樣硬化的影響及機制

發(fā)布時間：2020-10-11 10:29

　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死和外周血管疾病的主要原因。AS的發(fā)病機制十分復雜,主要包括血管內(nèi)皮細胞損傷、脂質(zhì)代謝異常、炎癥與免疫等。其中脂質(zhì)代謝異常是AS的病理基礎(chǔ),主要包括高膽固醇血癥、高甘油三脂血癥、低密度脂蛋白代謝異常和高密度脂蛋白代謝異常等。研究顯示高甘油三酯血癥是冠心病、高血壓、糖尿病等代謝綜合征相關(guān)疾病發(fā)生的重要危險因素。因此,研究調(diào)控血漿甘油三酯代謝的機制對于AS防治具有重要意義。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是一種分泌型糖蛋白,通過水解富含甘油三酯脂蛋白如極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)、乳糜微粒(Chylomicron,CM)核心的甘油三酯(triglyceride,TG),降低血漿TG水平。研究發(fā)現(xiàn),敲除小鼠LPL后,其血漿TG水平顯著升高,主動脈根部出現(xiàn)AS斑塊;而過表達肌肉組織、心臟和脂肪組織的LPL能夠顯著降低血漿TG水平,減少AS斑塊面積,提示LPL是調(diào)控血漿TG代謝的關(guān)鍵酶,能夠有效防止AS發(fā)生發(fā)展。研究顯示代謝綜合征患者體內(nèi)LPL甲基化水平增加,并且LPL甲基化水平與血漿TG水平和代謝特征異常呈正相關(guān)。因此尋找抑制LPL甲基化修飾的機制,對于調(diào)控血漿TG代謝具有重要意義。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白80(coiled-coil domain-containing protein 80,CCDC80)是一種由脂肪細胞、平滑肌細胞等表達和分泌的蛋白。CCDC80能夠促進肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展,并增加肥胖相關(guān)的代謝性疾病發(fā)病風險。研究顯示,在肥胖患者血漿CCDC80水平顯著增加,并與禁食狀態(tài)下血漿TG水平和動脈粥樣硬化程度呈正相關(guān),提示CCDC80可能參與AS發(fā)生發(fā)展過程。因此,研究CCDC80對LPL介導的TG水解及AS的發(fā)生發(fā)展的影響及機制具有重要的意義。調(diào)控CCDC80表達的作用機制尚未闡明。大量研究證實,非編碼RNAs在脂質(zhì)代謝及AS過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)通過與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3'untranslated region,3’UTR))結(jié)合抑制其表達,參與AS發(fā)生發(fā)展的多個階段。mi R-141-3p/200a-3p參與脂質(zhì)代謝過程,但具體機制未明。生物信息學預測顯示mi R-141-3p/200a-3p能夠與CCDC80的3’UTR結(jié)合,提示mi R-141-3p/200a-3p可能通過調(diào)控CCDC80表達參與LPL表達調(diào)控。長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lnc RNAs)可通過與mi RNAs相互作用調(diào)控脂質(zhì)代謝過程參與AS進程。長鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄因子-1(lnc RNA metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1,lnc RNA MALAT1)通過調(diào)控CDC36表達影響泡沫細胞形成,表明lnc RNA MALAT1參與脂質(zhì)代謝過程,但其對CCDC80與LPL的調(diào)控作用尚未闡明。生物信息學預測發(fā)現(xiàn)lnc RNA MALAT1能夠與mi R-141-3p/200a-3p序列結(jié)合,提示MALAT1可能通過mi R-141-3p/200a-3p參與CCDC80及LPL表達調(diào)控。據(jù)此,我們將研究分為如下四個部分:(1)培養(yǎng)VSMCs,過表達或沉默CCDC80,檢測LPL表達水平,明確CCDC80對LPL的調(diào)控作用;(2)過表達或沉默CCDC80、TET2,檢測ERK1/2磷酸化水平、TET2表達、LPL啟動子DNA甲基化水平、LPL表達,闡明CCDC80通過ERK1/2-TET2途徑促進LPL啟動子DNA甲基化,抑制LPL表達的分子機制;(3)以Apo E-/-小鼠為實驗對象,轉(zhuǎn)染CCDC80或sh CCDC80,觀察其對Apo E-/-小鼠主動脈LPL表達,血漿脂質(zhì)水平、主動脈脂質(zhì)蓄積情況和As斑塊面積的影響,整體水平明確CCDC80促As的作用機制;(4)mi R-141-3p/200a-3p mimic/inhibitor或MALAT1/si MALAT1轉(zhuǎn)染VSMCs,檢測CCDCC80和LPL表達情況明確MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p對CCDC80與LPL的調(diào)控作用。第一部分CCDC80抑制人主動脈血管平滑肌細胞LPL表達目的:研究CCDC80對血管平滑肌細胞LPL表達的影響。方法:使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人主動脈血管平滑肌細胞(human artery vascular smooth muscle cells,HA-VSMCs),構(gòu)建CCDC80過表達和沉默載體并分別轉(zhuǎn)染細胞,通過Western Blot檢測CCDC80過表達與沉默效果;q PCR和Western Blot方法分別檢測LPL m RNA和蛋白表達水平。結(jié)果:細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CCDC80或CCDC80 sh RNA。q PCR和Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn),CCDC80過表達顯著下調(diào)HA-VSMCs中LPL m RNA和蛋白表達;CCDC80 sh RNA處理顯著上調(diào)HA-VSMCs中LPL m RNA和蛋白表達。小結(jié):CCDC80過表達下調(diào)LPL m RNA和蛋白表達,而沉默CCDC80則上調(diào)LPL m RNA和蛋白表達。第二部分CCDC80抑制LPL表達的分子機制目的:研究CCDC80影響LPL表達的作用機制。方法:使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HA-VSMCs,使用CCDC80或CCDC80 sh RNA轉(zhuǎn)染細胞,Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效果;Western Blot方法檢測細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)水平以及磷酸化ERK1/2水平;VSMCs細胞使用10μM的ERK1/2激動劑Curcumin或抑制劑PD98059處理,q PCR和Western Blot方法分別檢測LPL m RNA和蛋白表達水平;明確CCDC80通過ERK1/2調(diào)控LPL表達。過表達或沉默CCDC80,采用甲基化特異性PCR方法檢測LPL啟動子DNA甲基化水平;相應方法檢測細胞5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-m C)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hm C)水平;q PCR和Western Blot方法分別檢測TET甲基胞嘧啶雙加氧酶2(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 2,TET2)m RNA和蛋白表達水平;過表達或沉默TET2,Western Blot方法檢測TET2轉(zhuǎn)染效果;采用甲基化特異性PCR方法檢測LPL啟動子DNA甲基化水平;相應方法檢測細胞5-m C和5-hm C水平;q PCR和Western Blot方法分別檢測LPL m RNA和蛋白表達水平,明確CCDC80通過TET2影響LPL啟動子DNA甲基化修飾進而調(diào)控其表達。過表達或沉默CCDC80,同時HA-VSMCs使用10μM的ERK1/2激動劑Curcumin或抑制劑PD98059處理,Western Blot檢測TET2和LPL的表達情況;HA-VSMCs轉(zhuǎn)染CCDC80 sh RNA,免疫共沉淀方法檢測TET2與FOXO3a的結(jié)合情況。使用FOXO3a si RNA轉(zhuǎn)染HA-VSMCs,Western Blot檢測沉默效果,q PCR和Western Blot檢測LPL m RNA和蛋白表達情況。結(jié)果:CCDC80或CCDC80 sh RNA在細胞穩(wěn)定表達。q PCR和Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn),CCDC80過表達顯著下調(diào)HA-VSMCs中LPL、TET2 m RNA和蛋白表達;降低ERK1/2磷酸化水平,但并不影響總的ERK1/2水平;增加5-m C水平,降低5-hm C水平。甲基化特異性PCR結(jié)果顯示CCDC80過表達顯著增加LPL啟動子DNA甲基化水平。CCDC80 sh RNA處理顯著上調(diào)LPL和TET2表達;增加p-ERK1/2和5hm C水平;降低LPL啟動子DNA甲基化和5m C水平。CCDC80 sh RNA與ERK1/2抑制劑PD98059共同處理能夠下調(diào)LPL和TET2表達,增加LPL啟動子DNA甲基化水平和5-m C水平,降低5-hm C水平;而CCDC80與ERK1/2激動劑Curcumin共同處理則上調(diào)LPL和TET2表達,降低LPL啟動子DNA甲基化水平和5-m C水平,增加5-hm C水平,免疫共沉淀結(jié)果顯示CCDC80 sh RNA顯著減少TET2與FOXO3a的相互作用。FOXO3a si RNA能夠部分阻斷CCDC80 sh RNA對LPL表達的上調(diào)作用。小結(jié):(1)CCDC80通過增加LPL啟動子DNA甲基化水平,從而抑制LPL表達。(2)CCDC80通過降低ERK1/2磷酸化水平,下調(diào)TET2表達,促進LPL啟動子DNA甲基化修飾,抑制LPL表達。(3)CCDC80通過抑制FOXO3a與TET2的相互作用參與對LPL表達的調(diào)控。第三部分CCDC80加速apoE~(-/-)小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成目的:以apo E基因敲除(apolipoprotein E deficiency,apoE~(-/-))小鼠為研究對象,探討CCDC80對apoE~(-/-)小鼠LPL表達與活性、血漿脂質(zhì)水平及AS斑塊形成的影響。方法:將8周齡的雄性apoE~(-/-)小鼠隨機分為對照組(Control組)、CCDC80過表達組(CCDC80組)和CCDC80沉默組(sh CCDC80組),每組10只,分別轉(zhuǎn)染重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus,r AA)、r AA-CCDC80和r AA-sh CCDC80。Apo E-/-小鼠采用高脂/高膽固醇飲食喂養(yǎng)12周后進行安樂死。分離各組apoE~(-/-)小鼠主動脈,Western Blot檢測主動脈CCDC80蛋白表達情況,明確轉(zhuǎn)染效果。喂養(yǎng)期間每兩周對小鼠進行稱重并記錄。在處死前,給禁食12小時的apoE~(-/-)小鼠注射300 U/kg肝素,十分鐘后通過摘眼球取血。血液收集到具有EDTA的管中進行離心獲得血漿,采用化學發(fā)光法檢測血液樣本中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(cerealthirdtransaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平;采用商業(yè)酶試劑盒檢測血漿中總膽固醇(total cholesterol,TC)、非高密度脂蛋白膽固醇(non-high density lipoprotein cholesterol,non-HDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)以及TG水平,LPL活性檢測試劑盒檢測肝素處理后血漿中LPL活性。分離各組apoE~(-/-)小鼠主動脈,q PCR和Western Blot檢測LPL表達情況。主動脈竇冰凍切片,免疫熒光染色檢測LPL表達、LPL與血管平滑肌細胞標志物α平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)定位情況。分離各組小鼠主動脈弓,通過體視顯微鏡觀察主動脈弓處AS斑塊面積�？v向剖開主動脈(從主動脈弓到髂總動脈分支處),油紅O染色觀察脂質(zhì)蓄積情況。分別用HE、Masson和油紅O染色檢測主動脈竇AS斑塊面積、膠原含量以及脂質(zhì)蓄積情況。結(jié)果:采用Western Blot檢測主動脈CCDC80表達情況,結(jié)果顯示高脂高膽固醇飲食喂養(yǎng)的apoE~(-/-)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CCDC80。過表達或沉默CCDC80不影響小鼠的體重。CCDC80過表達或沉默對血漿中ALT、AST和ALP的含量無影響,說明CCDC80過表達或沉默不影響小鼠的肝功能。CCDC80過表達顯著增加血漿TC、non-HDL-C和TG水平,對HDL-C水平無影響。CCDC80過表達顯著降低血漿LPL活性,減少主動脈LPL表達,免疫熒光結(jié)果顯示CCDC80過表達顯著降低主動脈瓣膜斑塊處LPL的熒光強度,同時發(fā)現(xiàn)主動脈瓣膜斑塊處LPL與α-SMA存在共定位現(xiàn)象;CCDC80過表達增加apoE~(-/-)小鼠主動脈弓處的斑塊面積,促進主動脈內(nèi)脂質(zhì)蓄積,增加主動脈竇內(nèi)AS斑塊面積和脂質(zhì)蓄積,加速AS的發(fā)生。而sh CCDC80增加LPL表達和活性,降低血漿TC、non-HDL-C和TG水平,減少主動脈脂質(zhì)蓄積,抑制AS斑塊形成,延緩apoE~(-/-)小鼠AS發(fā)生發(fā)展。小結(jié):(1)CCDC80通過抑制LPL m RNA和蛋白表達,降低血漿LPL活性,升高血漿脂質(zhì)水平從而加速apoE~(-/-)小鼠AS斑塊形成。第四部分MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p對CCDC80的表達調(diào)控目的:研究MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p對CCDC80表達的調(diào)控作用。方法:通過生物信息學網(wǎng)站分析與CCDC80的3’UTR相互作用的mi RNAs,并分析兩者結(jié)合自由能情況。然后通過培養(yǎng)HEK 293T細胞,使用熒光素酶報告基因的方法檢測mi R-141-3p/200a-3p與CCDC80的結(jié)合情況。用40μM mi R-141-3p/200a-3p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染HA-VSMCs 24小時,隨后通過q PCR檢測轉(zhuǎn)染效率;q PCR和Western Blot方法分別檢測CCDC80和LPL m RNA與蛋白表達情況。通過生物信息學網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)lnc RNA MALAT1與mi R-141-3p和mi R-200a-3p存在相互作用。培養(yǎng)HEK 293T細胞,通過熒光素酶報告基因檢測兩者結(jié)合情況。細胞轉(zhuǎn)染MALAT1或MALAT1 si RNA,q PCR檢測過表達與沉默效果,并檢測過表達或沉默lnc RNA MALAT1對mi R-141-3p和mi R-200a-3p表達的影響。lnc RNA MALAT1與mi R-141-3p mimic或mi R-200a-3p mimic共同轉(zhuǎn)染HA-VSMCs,q PCR和Western Blot方法分別檢測CCDC80和LPL m RNA和蛋白表達情況;lnc RNA MALAT1 si RNA與mi R-141-3p/200a-3p inhibitors共同轉(zhuǎn)染HA-VSMCs,q PCR和Western Blot方法分別檢測CCDC80和LPL m RNA和蛋白表達情況。結(jié)果:生物信息學結(jié)果顯示CCDC80的3’UTR與mi R-141-3p/200a-3p存在結(jié)合情況,CCDC80在不同物種中序列高度保守。此外分析發(fā)現(xiàn)mi R-141-3p與mi R-200a-3p序列高度保守,只有一個堿基序列不同。Mi R-141-3p/200a-3p與CCDC80的結(jié)合自由能較低。熒光素酶報告基因顯示mi R-141-3p/200a-3p與CCDC80的3’UTR存在結(jié)合,能夠顯著降低其熒光素酶活性,但不與突變的CCDC80的3’UTR發(fā)生結(jié)合。使用mi R-141-3p mimic和mi R-200a-3p mimic轉(zhuǎn)染細胞,mi R-141-3p和mi R-200a-3p表達水平顯著增加,并能夠顯著下調(diào)CCDC80 m RNA和蛋白表達,但增加LPL m RNA和蛋白表達水平。而mi R-141-3p inhibitor和mi R-200a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染細胞顯著降低mi R-141-3p和mi R-200a-3p表達水平,增加CCDC80表達,下調(diào)LPL表達。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)lnc RNA MALAT1與mi R-141-3p和mi R-200a-3p存在結(jié)合位點;熒光素酶報告基因證實lnc RNA MALAT1能夠與mi R-141-3p和mi R-200a-3p進行結(jié)合。VSMCs通過轉(zhuǎn)染lnc RNA MALAT1或MALAT1 si RNA,q PCR檢測證實lnc RNA MAMLT過表達和干擾成功;同時結(jié)果顯示lnc RNA MALAT1過表達減少mi R-141-3p和mi R-200a-3p表達水平,而lnc RNA MALAT1 si RNA增加其表達水平。q PCR和western blot檢測結(jié)果顯示,mi R-141-3p/200a-3p mimics顯著抑制lnc RNA MALAT1對CCDC80表達上調(diào)和LPL表達下調(diào)的作用;mi R-141-3p/200a-3p inhibitors則顯著抑制lnc RNA MALAT1 si RNA對CCDC80表達的下調(diào)和LPL表達的上調(diào)作用。小結(jié):(1)mi R-141-3p和mi R-200a-3p序列高度保守,兩種通過與CCDC80的3’UTR序列結(jié)合抑制其表達。(2)mi R-141-3p/200a-3p通過抑制CCDC80參與LPL表達調(diào)控。(3)lnc RNA MALAT1能夠與mi R-141-3p和mi R-200a-3p序列結(jié)合并抑制其表達�！�4 lnc RNA MALAT1通過降低mi R-141-3p/200a-3p水平,促進CCDC80表達,抑制LPL表達。結(jié)論1.CCDC80抑制人主動脈血管平滑肌細胞中LPL m RNA和蛋白表達。2.CCDC80通過抑制ERK1/2的激活,下調(diào)TET2表達,從而增加LPL啟動子DNA甲基化水平,抑制LPL表達,FOXO3a部分參與CCDC80對LPL的表達調(diào)控。3.CCDC80抑制LPL表達和活性,增加血漿脂質(zhì)水平,加速apoE~(-/-)小鼠AS斑塊形成。4.CCDC80表達受到MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p的調(diào)控。
【學位單位】：南華大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R543.5
【部分圖文】：

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