當(dāng)前位置：主頁(yè) > 醫(yī)學(xué)論文 > 心血管論文 >

CCDC80下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞LPL表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及機(jī)制

發(fā)布時(shí)間：2020-10-11 10:29

　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死和外周血管疾病的主要原因。AS的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂質(zhì)代謝異常、炎癥與免疫等。其中脂質(zhì)代謝異常是AS的病理基礎(chǔ),主要包括高膽固醇血癥、高甘油三脂血癥、低密度脂蛋白代謝異常和高密度脂蛋白代謝異常等。研究顯示高甘油三酯血癥是冠心病、高血壓、糖尿病等代謝綜合征相關(guān)疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。因此,研究調(diào)控血漿甘油三酯代謝的機(jī)制對(duì)于AS防治具有重要意義。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是一種分泌型糖蛋白,通過(guò)水解富含甘油三酯脂蛋白如極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)、乳糜微粒(Chylomicron,CM)核心的甘油三酯(triglyceride,TG),降低血漿TG水平。研究發(fā)現(xiàn),敲除小鼠LPL后,其血漿TG水平顯著升高,主動(dòng)脈根部出現(xiàn)AS斑塊;而過(guò)表達(dá)肌肉組織、心臟和脂肪組織的LPL能夠顯著降低血漿TG水平,減少AS斑塊面積,提示LPL是調(diào)控血漿TG代謝的關(guān)鍵酶,能夠有效防止AS發(fā)生發(fā)展。研究顯示代謝綜合征患者體內(nèi)LPL甲基化水平增加,并且LPL甲基化水平與血漿TG水平和代謝特征異常呈正相關(guān)。因此尋找抑制LPL甲基化修飾的機(jī)制,對(duì)于調(diào)控血漿TG代謝具有重要意義。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白80(coiled-coil domain-containing protein 80,CCDC80)是一種由脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等表達(dá)和分泌的蛋白。CCDC80能夠促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展,并增加肥胖相關(guān)的代謝性疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。研究顯示,在肥胖患者血漿CCDC80水平顯著增加,并與禁食狀態(tài)下血漿TG水平和動(dòng)脈粥樣硬化程度呈正相關(guān),提示CCDC80可能參與AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程。因此,研究CCDC80對(duì)LPL介導(dǎo)的TG水解及AS的發(fā)生發(fā)展的影響及機(jī)制具有重要的意義。調(diào)控CCDC80表達(dá)的作用機(jī)制尚未闡明。大量研究證實(shí),非編碼RNAs在脂質(zhì)代謝及AS過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)通過(guò)與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3'untranslated region,3’UTR))結(jié)合抑制其表達(dá),參與AS發(fā)生發(fā)展的多個(gè)階段。mi R-141-3p/200a-3p參與脂質(zhì)代謝過(guò)程,但具體機(jī)制未明。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示mi R-141-3p/200a-3p能夠與CCDC80的3’UTR結(jié)合,提示mi R-141-3p/200a-3p可能通過(guò)調(diào)控CCDC80表達(dá)參與LPL表達(dá)調(diào)控。長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lnc RNAs)可通過(guò)與mi RNAs相互作用調(diào)控脂質(zhì)代謝過(guò)程參與AS進(jìn)程。長(zhǎng)鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄因子-1(lnc RNA metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1,lnc RNA MALAT1)通過(guò)調(diào)控CDC36表達(dá)影響泡沫細(xì)胞形成,表明lnc RNA MALAT1參與脂質(zhì)代謝過(guò)程,但其對(duì)CCDC80與LPL的調(diào)控作用尚未闡明。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)lnc RNA MALAT1能夠與mi R-141-3p/200a-3p序列結(jié)合,提示MALAT1可能通過(guò)mi R-141-3p/200a-3p參與CCDC80及LPL表達(dá)調(diào)控。據(jù)此,我們將研究分為如下四個(gè)部分:(1)培養(yǎng)VSMCs,過(guò)表達(dá)或沉默CCDC80,檢測(cè)LPL表達(dá)水平,明確CCDC80對(duì)LPL的調(diào)控作用;(2)過(guò)表達(dá)或沉默CCDC80、TET2,檢測(cè)ERK1/2磷酸化水平、TET2表達(dá)、LPL啟動(dòng)子DNA甲基化水平、LPL表達(dá),闡明CCDC80通過(guò)ERK1/2-TET2途徑促進(jìn)LPL啟動(dòng)子DNA甲基化,抑制LPL表達(dá)的分子機(jī)制;(3)以Apo E-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,轉(zhuǎn)染CCDC80或sh CCDC80,觀察其對(duì)Apo E-/-小鼠主動(dòng)脈LPL表達(dá),血漿脂質(zhì)水平、主動(dòng)脈脂質(zhì)蓄積情況和As斑塊面積的影響,整體水平明確CCDC80促As的作用機(jī)制;(4)mi R-141-3p/200a-3p mimic/inhibitor或MALAT1/si MALAT1轉(zhuǎn)染VSMCs,檢測(cè)CCDCC80和LPL表達(dá)情況明確MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p對(duì)CCDC80與LPL的調(diào)控作用。第一部分CCDC80抑制人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞LPL表達(dá)目的:研究CCDC80對(duì)血管平滑肌細(xì)胞LPL表達(dá)的影響。方法:使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(human artery vascular smooth muscle cells,HA-VSMCs),構(gòu)建CCDC80過(guò)表達(dá)和沉默載體并分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過(guò)Western Blot檢測(cè)CCDC80過(guò)表達(dá)與沉默效果;q PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)LPL m RNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CCDC80或CCDC80 sh RNA。q PCR和Western Blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CCDC80過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)HA-VSMCs中LPL m RNA和蛋白表達(dá);CCDC80 sh RNA處理顯著上調(diào)HA-VSMCs中LPL m RNA和蛋白表達(dá)。小結(jié):CCDC80過(guò)表達(dá)下調(diào)LPL m RNA和蛋白表達(dá),而沉默CCDC80則上調(diào)LPL m RNA和蛋白表達(dá)。第二部分CCDC80抑制LPL表達(dá)的分子機(jī)制目的:研究CCDC80影響LPL表達(dá)的作用機(jī)制。方法:使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HA-VSMCs,使用CCDC80或CCDC80 sh RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果;Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)水平以及磷酸化ERK1/2水平;VSMCs細(xì)胞使用10μM的ERK1/2激動(dòng)劑Curcumin或抑制劑PD98059處理,q PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)LPL m RNA和蛋白表達(dá)水平;明確CCDC80通過(guò)ERK1/2調(diào)控LPL表達(dá)。過(guò)表達(dá)或沉默CCDC80,采用甲基化特異性PCR方法檢測(cè)LPL啟動(dòng)子DNA甲基化水平;相應(yīng)方法檢測(cè)細(xì)胞5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-m C)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hm C)水平;q PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)TET甲基胞嘧啶雙加氧酶2(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 2,TET2)m RNA和蛋白表達(dá)水平;過(guò)表達(dá)或沉默TET2,Western Blot方法檢測(cè)TET2轉(zhuǎn)染效果;采用甲基化特異性PCR方法檢測(cè)LPL啟動(dòng)子DNA甲基化水平;相應(yīng)方法檢測(cè)細(xì)胞5-m C和5-hm C水平;q PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)LPL m RNA和蛋白表達(dá)水平,明確CCDC80通過(guò)TET2影響LPL啟動(dòng)子DNA甲基化修飾進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)。過(guò)表達(dá)或沉默CCDC80,同時(shí)HA-VSMCs使用10μM的ERK1/2激動(dòng)劑Curcumin或抑制劑PD98059處理,Western Blot檢測(cè)TET2和LPL的表達(dá)情況;HA-VSMCs轉(zhuǎn)染CCDC80 sh RNA,免疫共沉淀方法檢測(cè)TET2與FOXO3a的結(jié)合情況。使用FOXO3a si RNA轉(zhuǎn)染HA-VSMCs,Western Blot檢測(cè)沉默效果,q PCR和Western Blot檢測(cè)LPL m RNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:CCDC80或CCDC80 sh RNA在細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)。q PCR和Western Blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CCDC80過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)HA-VSMCs中LPL、TET2 m RNA和蛋白表達(dá);降低ERK1/2磷酸化水平,但并不影響總的ERK1/2水平;增加5-m C水平,降低5-hm C水平。甲基化特異性PCR結(jié)果顯示CCDC80過(guò)表達(dá)顯著增加LPL啟動(dòng)子DNA甲基化水平。CCDC80 sh RNA處理顯著上調(diào)LPL和TET2表達(dá);增加p-ERK1/2和5hm C水平;降低LPL啟動(dòng)子DNA甲基化和5m C水平。CCDC80 sh RNA與ERK1/2抑制劑PD98059共同處理能夠下調(diào)LPL和TET2表達(dá),增加LPL啟動(dòng)子DNA甲基化水平和5-m C水平,降低5-hm C水平;而CCDC80與ERK1/2激動(dòng)劑Curcumin共同處理則上調(diào)LPL和TET2表達(dá),降低LPL啟動(dòng)子DNA甲基化水平和5-m C水平,增加5-hm C水平,免疫共沉淀結(jié)果顯示CCDC80 sh RNA顯著減少TET2與FOXO3a的相互作用。FOXO3a si RNA能夠部分阻斷CCDC80 sh RNA對(duì)LPL表達(dá)的上調(diào)作用。小結(jié):(1)CCDC80通過(guò)增加LPL啟動(dòng)子DNA甲基化水平,從而抑制LPL表達(dá)。(2)CCDC80通過(guò)降低ERK1/2磷酸化水平,下調(diào)TET2表達(dá),促進(jìn)LPL啟動(dòng)子DNA甲基化修飾,抑制LPL表達(dá)。(3)CCDC80通過(guò)抑制FOXO3a與TET2的相互作用參與對(duì)LPL表達(dá)的調(diào)控。第三部分CCDC80加速apoE~(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成目的:以apo E基因敲除(apolipoprotein E deficiency,apoE~(-/-))小鼠為研究對(duì)象,探討CCDC80對(duì)apoE~(-/-)小鼠LPL表達(dá)與活性、血漿脂質(zhì)水平及AS斑塊形成的影響。方法:將8周齡的雄性apoE~(-/-)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、CCDC80過(guò)表達(dá)組(CCDC80組)和CCDC80沉默組(sh CCDC80組),每組10只,分別轉(zhuǎn)染重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus,r AA)、r AA-CCDC80和r AA-sh CCDC80。Apo E-/-小鼠采用高脂/高膽固醇飲食喂養(yǎng)12周后進(jìn)行安樂(lè)死。分離各組apoE~(-/-)小鼠主動(dòng)脈,Western Blot檢測(cè)主動(dòng)脈CCDC80蛋白表達(dá)情況,明確轉(zhuǎn)染效果。喂養(yǎng)期間每?jī)芍軐?duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重并記錄。在處死前,給禁食12小時(shí)的apoE~(-/-)小鼠注射300 U/kg肝素,十分鐘后通過(guò)摘眼球取血。血液收集到具有EDTA的管中進(jìn)行離心獲得血漿,采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血液樣本中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(cerealthirdtransaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平;采用商業(yè)酶試劑盒檢測(cè)血漿中總膽固醇(total cholesterol,TC)、非高密度脂蛋白膽固醇(non-high density lipoprotein cholesterol,non-HDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)以及TG水平,LPL活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝素處理后血漿中LPL活性。分離各組apoE~(-/-)小鼠主動(dòng)脈,q PCR和Western Blot檢測(cè)LPL表達(dá)情況。主動(dòng)脈竇冰凍切片,免疫熒光染色檢測(cè)LPL表達(dá)、LPL與血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)定位情況。分離各組小鼠主動(dòng)脈弓,通過(guò)體視顯微鏡觀察主動(dòng)脈弓處AS斑塊面積�？v向剖開(kāi)主動(dòng)脈(從主動(dòng)脈弓到髂總動(dòng)脈分支處),油紅O染色觀察脂質(zhì)蓄積情況。分別用HE、Masson和油紅O染色檢測(cè)主動(dòng)脈竇AS斑塊面積、膠原含量以及脂質(zhì)蓄積情況。結(jié)果:采用Western Blot檢測(cè)主動(dòng)脈CCDC80表達(dá)情況,結(jié)果顯示高脂高膽固醇飲食喂養(yǎng)的apoE~(-/-)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CCDC80。過(guò)表達(dá)或沉默CCDC80不影響小鼠的體重。CCDC80過(guò)表達(dá)或沉默對(duì)血漿中ALT、AST和ALP的含量無(wú)影響,說(shuō)明CCDC80過(guò)表達(dá)或沉默不影響小鼠的肝功能。CCDC80過(guò)表達(dá)顯著增加血漿TC、non-HDL-C和TG水平,對(duì)HDL-C水平無(wú)影響。CCDC80過(guò)表達(dá)顯著降低血漿LPL活性,減少主動(dòng)脈LPL表達(dá),免疫熒光結(jié)果顯示CCDC80過(guò)表達(dá)顯著降低主動(dòng)脈瓣膜斑塊處LPL的熒光強(qiáng)度,同時(shí)發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈瓣膜斑塊處LPL與α-SMA存在共定位現(xiàn)象;CCDC80過(guò)表達(dá)增加apoE~(-/-)小鼠主動(dòng)脈弓處的斑塊面積,促進(jìn)主動(dòng)脈內(nèi)脂質(zhì)蓄積,增加主動(dòng)脈竇內(nèi)AS斑塊面積和脂質(zhì)蓄積,加速AS的發(fā)生。而sh CCDC80增加LPL表達(dá)和活性,降低血漿TC、non-HDL-C和TG水平,減少主動(dòng)脈脂質(zhì)蓄積,抑制AS斑塊形成,延緩apoE~(-/-)小鼠AS發(fā)生發(fā)展。小結(jié):(1)CCDC80通過(guò)抑制LPL m RNA和蛋白表達(dá),降低血漿LPL活性,升高血漿脂質(zhì)水平從而加速apoE~(-/-)小鼠AS斑塊形成。第四部分MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p對(duì)CCDC80的表達(dá)調(diào)控目的:研究MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p對(duì)CCDC80表達(dá)的調(diào)控作用。方法:通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站分析與CCDC80的3’UTR相互作用的mi RNAs,并分析兩者結(jié)合自由能情況。然后通過(guò)培養(yǎng)HEK 293T細(xì)胞,使用熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)mi R-141-3p/200a-3p與CCDC80的結(jié)合情況。用40μM mi R-141-3p/200a-3p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染HA-VSMCs 24小時(shí),隨后通過(guò)q PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;q PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)CCDC80和LPL m RNA與蛋白表達(dá)情況。通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)lnc RNA MALAT1與mi R-141-3p和mi R-200a-3p存在相互作用。培養(yǎng)HEK 293T細(xì)胞,通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)兩者結(jié)合情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)染MALAT1或MALAT1 si RNA,q PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)與沉默效果,并檢測(cè)過(guò)表達(dá)或沉默lnc RNA MALAT1對(duì)mi R-141-3p和mi R-200a-3p表達(dá)的影響。lnc RNA MALAT1與mi R-141-3p mimic或mi R-200a-3p mimic共同轉(zhuǎn)染HA-VSMCs,q PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)CCDC80和LPL m RNA和蛋白表達(dá)情況;lnc RNA MALAT1 si RNA與mi R-141-3p/200a-3p inhibitors共同轉(zhuǎn)染HA-VSMCs,q PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)CCDC80和LPL m RNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:生物信息學(xué)結(jié)果顯示CCDC80的3’UTR與mi R-141-3p/200a-3p存在結(jié)合情況,CCDC80在不同物種中序列高度保守。此外分析發(fā)現(xiàn)mi R-141-3p與mi R-200a-3p序列高度保守,只有一個(gè)堿基序列不同。Mi R-141-3p/200a-3p與CCDC80的結(jié)合自由能較低。熒光素酶報(bào)告基因顯示mi R-141-3p/200a-3p與CCDC80的3’UTR存在結(jié)合,能夠顯著降低其熒光素酶活性,但不與突變的CCDC80的3’UTR發(fā)生結(jié)合。使用mi R-141-3p mimic和mi R-200a-3p mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞,mi R-141-3p和mi R-200a-3p表達(dá)水平顯著增加,并能夠顯著下調(diào)CCDC80 m RNA和蛋白表達(dá),但增加LPL m RNA和蛋白表達(dá)水平。而mi R-141-3p inhibitor和mi R-200a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著降低mi R-141-3p和mi R-200a-3p表達(dá)水平,增加CCDC80表達(dá),下調(diào)LPL表達(dá)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)lnc RNA MALAT1與mi R-141-3p和mi R-200a-3p存在結(jié)合位點(diǎn);熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)lnc RNA MALAT1能夠與mi R-141-3p和mi R-200a-3p進(jìn)行結(jié)合。VSMCs通過(guò)轉(zhuǎn)染lnc RNA MALAT1或MALAT1 si RNA,q PCR檢測(cè)證實(shí)lnc RNA MAMLT過(guò)表達(dá)和干擾成功;同時(shí)結(jié)果顯示lnc RNA MALAT1過(guò)表達(dá)減少mi R-141-3p和mi R-200a-3p表達(dá)水平,而lnc RNA MALAT1 si RNA增加其表達(dá)水平。q PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,mi R-141-3p/200a-3p mimics顯著抑制lnc RNA MALAT1對(duì)CCDC80表達(dá)上調(diào)和LPL表達(dá)下調(diào)的作用;mi R-141-3p/200a-3p inhibitors則顯著抑制lnc RNA MALAT1 si RNA對(duì)CCDC80表達(dá)的下調(diào)和LPL表達(dá)的上調(diào)作用。小結(jié):(1)mi R-141-3p和mi R-200a-3p序列高度保守,兩種通過(guò)與CCDC80的3’UTR序列結(jié)合抑制其表達(dá)。(2)mi R-141-3p/200a-3p通過(guò)抑制CCDC80參與LPL表達(dá)調(diào)控。(3)lnc RNA MALAT1能夠與mi R-141-3p和mi R-200a-3p序列結(jié)合并抑制其表達(dá)�！�4 lnc RNA MALAT1通過(guò)降低mi R-141-3p/200a-3p水平,促進(jìn)CCDC80表達(dá),抑制LPL表達(dá)。結(jié)論1.CCDC80抑制人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中LPL m RNA和蛋白表達(dá)。2.CCDC80通過(guò)抑制ERK1/2的激活,下調(diào)TET2表達(dá),從而增加LPL啟動(dòng)子DNA甲基化水平,抑制LPL表達(dá),FOXO3a部分參與CCDC80對(duì)LPL的表達(dá)調(diào)控。3.CCDC80抑制LPL表達(dá)和活性,增加血漿脂質(zhì)水平,加速apoE~(-/-)小鼠AS斑塊形成。4.CCDC80表達(dá)受到MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p的調(diào)控。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R543.5
【部分圖文】：

過(guò)表達(dá)