目的:心衰(HF)患者B型利鈉肽(BNP)水平升高,但生物功能和抗HF作用減弱,這即BNP悖論,機制不明。可能的解釋是HF患者BNP全長形式減少,截短形式增多,而后者與利鈉肽A型受體(NPR-A)的相互作用和產(chǎn)生的生物功能減弱。本研究從受體互作角度,探討B(tài)NP不同形式與NPR-A的相互作用和對過表達NPR-A細胞的生物作用。從基因調控層面,通過分析基因突變[單核苷酸多態(tài)性(SNP)]和表觀遺傳學[脫氧核糖核酸(DNA)甲基化和外泌體微小核糖核酸(miRNA)]探索影響B(tài)NP前體(NPPB)基因轉錄與HF和房顫(AF)發(fā)生發(fā)展的機制。從臨床應用方面,分析氮端B型利鈉肽前體(NT-proBNP)判斷HF和AF老年患者預后的能力。這些均有助于闡明BNP悖論的機制、解釋HF和AF的病程和探索創(chuàng)新性治療靶點。方法:酶聯(lián)免疫吸附和表面等離子共振技術檢測BNP與NPR-A蛋白的相互作用。CCK-8、Transwell和流式技術分別檢測細胞增殖、遷移和凋亡。重測序和MassArray技術檢測NPPB基因的SNP位點和甲基化程度。高通量測序檢測AF外泌體miRNA。納入306例HF和219例AF老年患者,COX回歸和ROC曲線分析NT-proBNP的預后判斷能力。結果:1.BNP1-29等C端截短肽及置換肽與NPR-A蛋白和過表達NPR-A的HEK293T細胞的相互作用較BNP1-32全長肽及BNP3-32等N端截短肽明顯減弱(均P0.05)。BNP1-29等C端截短肽及置換肽促進過表達NPR-A的HEK293T細胞增殖、遷移和抑制HEK293T細胞凋亡的生物作用較BNP1-32全長肽及BNP3-32等N端截短肽明顯減弱(均P0.05);2.NPPB基因3個外顯子和2個內含子區(qū)未發(fā)現(xiàn)SNP位點,即BNP截短形式的產(chǎn)生與基因突變無關。非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)三個SNP位點,即啟動子區(qū)的rs198389、5'非編碼區(qū)的rs3753581和3'非編碼區(qū)的rs198388。啟動子區(qū)的rs198389位點突變與射血分數(shù)明顯負相關,且突變組熒光素酶活性明顯降低(均P0.05);3.NPPB基因在HF組和非HF組之間存在甲基化程度明顯差異位點(P0.05);4.血漿NT-proBNP水平與HF和AF老年患者全因死亡率明顯獨立相關(均P0.05)。與西雅圖HF評分相比,血漿NT-proBNP水平和基于它的模型有類似的C-statistic值(均P0.05)。與CHADS2和CHA2DS2VASc評分相比,血漿NT-proBNP水平和基于它的模型有明顯高的C-statistic值(均P0.05);5.持續(xù)性AF患者已知miRNA和對應靶基因的數(shù)量明顯多于非AF人群(均P0.05);結論:BNP1-32的C端,而非N端,缺失明顯抑制BNP與NPR-A的相互結合和發(fā)揮生物功能,說明胰島素降解酶可能是影響B(tài)NP活性的關鍵酶。NPPB基因SNP位點rs198389突變后抑制轉錄,且與收縮功能相關,說明其可能通過減少BNP合成導致心功能惡化。HF患者NPPB基因存在甲基化差異位點,說明其甲基化可能與HF發(fā)病相關。NT-proBNP是與HF和AF老年患者不良預后獨立相關的生物標志物,基于它的模型也能很好地判斷預后。AF外泌體miRNA生物信息圖譜得以建立。
【學位單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R541.6
【部分圖文】：

解放軍醫(yī)學院博士學位論文Ｐ１－３２邋全長肽（表邋１）；逡逑Ｐ３－３２、ＢＮＰ４－３２和ＢＮＰ５－３２等Ｎ端三個氨基酸截短肽（表Ｐ１－２９、ＢＮＰ３－２９、ＢＮＰ４－２９和ＢＮＰ５－２９等Ｃ端三個氨基酸）；逡逑氨酸（Ａｌａ）置換ＢＮＰ１－３２的Ｃ端氨基酸并合成了邋ＢＮＰ－ＡＲＨ和Ｃ端氨基酸置換肽（表１）；逡逑ｉ？？＞逡逑

．凝膠電泳驗證利鈉肽Ａ型受分析（ＥＬＩＳＡ）間接法分ＮＰＲ－Ａ蛋白的結合逡逑被ＮＰＲ－Ａ蛋白，濃度ｌ＾ｇ沖液（ＰＢＳ）洗板３次，２００ｆｉＬ／孔，３７°Ｃ孵育邋３０ｍ３次，加入ＢＮＰｌ－３２全始１：５以含１％ＢＳＡ的ｌｘＬ邋和邋０．８［ｘｇ／ｍＬ，２００（ｘＬ／孔邋洗板邋６邋次，加入小鼠邋ＩｇＧ邋Ｐ１－３２全長肽、截短肽和ｒｇ－Ｌｙｓ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｓ

Ａ型受體基因病毒感染后的人胚腎２９３Ｔ細胞（過表達）、空腎２９３Ｔ細胞（陰性對照）和無病毒感染的人胚腎２９３Ｔ細胞（２加入合適濃度的抗生素，篩選４８ｈ。熒光顯微鏡下觀況（圖５），熒光效率需要達到１００％后，降低抗生ｌ．ＯＯ＾ｇ／ｍＬ，繼續(xù)對感染后的細胞進行篩選和擴增。胞（圖６），通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（ｑＰＣＲ）基因轉錄的信使核糖核酸水平，證實ＯＥ組ＮＰＲ－Ａ基是ＮＣ組的１５７．６５倍（Ｐ＜０．０５；圖７）。通過免疫印表達豐度，證實ＯＥ組ＮＰＲ－Ａ基因的表達豐度明顯８）逡逑３．２．１收集細胞（６孔板８０％細胞密度），２０００邋ｒｐｍ，去上清，Ｔｒｉｚｏｌ試劑盒（普飛）抽提總ＲＮＡ，Ｎａｎｏｄ

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本文編號：2829895