發(fā)布時(shí)間：2020-09-26 19:58

　　 心肌梗死(myocardial infarction,MI)是全球范圍內(nèi)心源性猝死的最主要原因。由于成體的心肌細(xì)胞(cardiomyocytes,CMs)屬于終末分化的永久細(xì)胞,幾乎沒(méi)有再生能力,故心肌細(xì)胞一旦受損將不可避免地發(fā)生纖維性修復(fù),喪失了原有心肌的收縮功能。干細(xì)胞由于自身具有強(qiáng)大的自我更新和分化潛能,為心肌損傷的細(xì)胞治療帶來(lái)了新的希望,尤其是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),以其提取無(wú)創(chuàng),分離簡(jiǎn)便,無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn),已成為該領(lǐng)域基礎(chǔ)和應(yīng)用研究的熱點(diǎn)。機(jī)體內(nèi)不同器官和組織,由于所處位置及功能的不同而具有不同的硬度。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)人工制備不同硬度的生物材料或支架用于細(xì)胞的體內(nèi)外研究,不僅可以體外模擬細(xì)胞外基質(zhì)為細(xì)胞提供支撐,而且還可以通過(guò)調(diào)節(jié)生物支架的微結(jié)構(gòu)來(lái)影響細(xì)胞的行為,進(jìn)而用于指導(dǎo)干細(xì)胞定向分化。Piezo是一種能感受細(xì)胞膜機(jī)械力變化并迅速做出反應(yīng)的機(jī)械敏感性非選擇性陽(yáng)離子通道,具有壓力激活的特性,研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)硬度等機(jī)械力刺激能夠激活Piezo1,從而調(diào)控干細(xì)胞分化。已知成熟的正常心肌組織硬度約10-20kPa,心肌梗死發(fā)生后由于細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積累可致其組織硬度增加到35-70kPa。本論文利用模擬健康或疾病狀態(tài)下心臟組織硬度的生物材料,觀察其對(duì)調(diào)控hUC-MSCs向心肌細(xì)胞方向分化的作用及Piezo1在此過(guò)程中發(fā)揮的作用,為尋找損傷心肌細(xì)胞的替代細(xì)胞提出新思路。通過(guò)組織塊培養(yǎng)法獲得狀態(tài)良好的原代hUC-MSCs,對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞高表達(dá)CD44、CD90和CD105,不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45,表明該細(xì)胞具有MSCs的表型特征。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期工作制備了硬度分別為13-16kPa(軟)和62-68kPa(硬)的聚丙烯酰胺水凝膠(Polyacrylamide,PAAM),將P5或P6代次的hUC-MSCs接種在這兩種不同硬度基質(zhì)上培養(yǎng)(day1、day7和day14),觀察細(xì)胞的行為學(xué)變化以及成心肌分化的能力。在不同基質(zhì)硬度上,hUC-MSCs的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化:細(xì)胞在軟基質(zhì)上形態(tài)多呈現(xiàn)為短柱形,類(lèi)似于肌細(xì)胞;而在硬基質(zhì)上形態(tài)多呈現(xiàn)多角形,類(lèi)似于成骨細(xì)胞。通過(guò)qPCR檢測(cè)在這兩種不同的基質(zhì)硬度上早期心肌標(biāo)志物Nkx2.5、GATA4、Mesp1以及成熟標(biāo)志物cTnT、cTnI、α-actin的表達(dá),結(jié)果顯示,在13-16kPa的基質(zhì)硬度上,hUC-MSCs在第7天時(shí)均高表達(dá)早期以及成熟心肌標(biāo)志物;通過(guò)Western Blot進(jìn)一步檢測(cè)其蛋白水平的表達(dá),除cTnT外,在13-16 kPa的基質(zhì)硬度上心肌標(biāo)志物同樣在第7天時(shí)高表達(dá),表明13-16kPa的基質(zhì)硬度上hUC-MSCs傾向于心肌方向分化。而在62-68kPa的基質(zhì)硬度上,qPCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示僅Nkx2.5和α-actin均在第七天時(shí)表達(dá)高過(guò)于對(duì)照組,且低于13-16kPa,表明62-68kPa的基質(zhì)硬度對(duì)于hUC-MSCs向心肌方向分化的趨勢(shì)并不明顯。在基質(zhì)硬度誘導(dǎo)人hUC-MSCs成心肌向分化的過(guò)程中,Piezo的表達(dá)發(fā)生變化。發(fā)現(xiàn)在第1天時(shí)Piezo1隨硬度增加表達(dá)量增加,而Piezo2雖然也有一定的變化,但是不具有規(guī)律性,因此,選擇Piezo1作為之后的研究對(duì)象。在同一時(shí)間點(diǎn),在第1和7天,Piezo1隨基質(zhì)硬度增加而升高,在14天軟基質(zhì)明顯高于其余兩組;同一硬度上,Piezo1僅在第1天高表達(dá),在13-16kPa基質(zhì)硬度上Piezo1在隨時(shí)間表達(dá)趨于穩(wěn)定,在62-68kPa基質(zhì)硬度上Piezo1隨時(shí)間表達(dá)逐漸降低。這說(shuō)明在軟基質(zhì)上Piezo1僅在第1天對(duì)于基質(zhì)硬度敏感,在硬基質(zhì)上Piezo1的敏感度持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。同時(shí),檢測(cè)發(fā)現(xiàn)整合素β1和Ca~(2+)的表達(dá)也有明顯的變化,整合素β1和Ca~(2+)在軟基質(zhì)上表達(dá)低于硬基質(zhì)上。綜上所述,hUC-MSCs在硬度為13-16kPa的基質(zhì)上傾向于心肌分化,而在62-68 kPa的基質(zhì)上細(xì)胞向心肌方向分化的趨勢(shì)并不明顯。在此誘導(dǎo)分化過(guò)程中,Piezo1感知基質(zhì)硬度的力學(xué)刺激,可能通過(guò)與整合素β1相互影響以及調(diào)節(jié)Ca~(2+)濃度來(lái)發(fā)揮作用。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R542.22
【部分圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 hUC-MSCs的培養(yǎng)與鑒定3.1.1 hUC-MSCs的原代培養(yǎng)從吉林大學(xué)第一附屬醫(yī)院獲得正常足月胎兒臍帶（經(jīng)產(chǎn)婦本人同意），醫(yī)院倫理委員會(huì)獲準(zhǔn)。通過(guò)組織塊培養(yǎng)法從臍帶華通膠組織中分離得到大量狀態(tài)良好的原代細(xì)胞。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞大約在 5-10 天從組織塊爬出，剛開(kāi)始細(xì)胞數(shù)量少，且形態(tài)不均一。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞逐漸增多，多呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形。隨著傳代的進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)獲得的細(xì)胞已經(jīng)逐漸純化，得到的細(xì)胞的形態(tài)更加均一，當(dāng)細(xì)胞融合至 80%以上，細(xì)胞呈旋渦狀或魚(yú)群狀。細(xì)胞傳至 P10 代之后，其生長(zhǎng)緩慢，觀察其形態(tài)有分化的趨勢(shì)。因此，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的代次為 5-7 代。A B

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為驗(yàn)證獲得的細(xì)胞是否符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）制定的 MSCs 鑒定最低標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行流式以及免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞高表達(dá)粘附性分子CD44，CD90和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD105，不表達(dá)表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34，CD45，表明該細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特性。

圖 3.3 hUC-MSCs向成脂成骨誘導(dǎo)分化（A） hUC-MSCs向成脂細(xì)胞分化油紅O染色。Scale bar=50μm（B） hUC-MSCs向成骨細(xì)胞分化茜素紅染色。Scale bar=50μm3.2 基質(zhì)硬度的制備制備類(lèi)心肌組織與類(lèi)心肌纖維化組織硬度的聚丙烯酰胺水凝膠根據(jù)前期工作按照表 3.1 制備出 13-16kPa 和 62-68kPa 兩種不同硬度的聚丙烯酰胺水凝膠。本文是根據(jù)以往的文獻(xiàn)綜述進(jìn)行總結(jié)才選擇實(shí)驗(yàn)硬度為 13-16kPa（類(lèi)似心肌組織）、62-68kPa（類(lèi)似心肌纖維化組織）兩種基質(zhì)凝膠作為實(shí)驗(yàn)的基材。表 3.1 不同濃度的聚丙烯酰胺水凝膠的成分及比例硬度 丙烯酰胺 雙丙烯酰胺 催化劑13-16kPa 8% 0.1% AP、TEMED

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本文編號(hào)：2827424