心肌梗死(myocardial infarction,MI)是全球范圍內心源性猝死的最主要原因。由于成體的心肌細胞(cardiomyocytes,CMs)屬于終末分化的永久細胞,幾乎沒有再生能力,故心肌細胞一旦受損將不可避免地發(fā)生纖維性修復,喪失了原有心肌的收縮功能。干細胞由于自身具有強大的自我更新和分化潛能,為心肌損傷的細胞治療帶來了新的希望,尤其是人臍帶間充質干細胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),以其提取無創(chuàng),分離簡便,無倫理學爭議等優(yōu)點,已成為該領域基礎和應用研究的熱點。機體內不同器官和組織,由于所處位置及功能的不同而具有不同的硬度。研究發(fā)現(xiàn)通過人工制備不同硬度的生物材料或支架用于細胞的體內外研究,不僅可以體外模擬細胞外基質為細胞提供支撐,而且還可以通過調節(jié)生物支架的微結構來影響細胞的行為,進而用于指導干細胞定向分化。Piezo是一種能感受細胞膜機械力變化并迅速做出反應的機械敏感性非選擇性陽離子通道,具有壓力激活的特性,研究發(fā)現(xiàn)基質硬度等機械力刺激能夠激活Piezo1,從而調控干細胞分化。已知成熟的正常心肌組織硬度約10-20kPa,心肌梗死發(fā)生后由于細胞外基質的過度積累可致其組織硬度增加到35-70kPa。本論文利用模擬健康或疾病狀態(tài)下心臟組織硬度的生物材料,觀察其對調控hUC-MSCs向心肌細胞方向分化的作用及Piezo1在此過程中發(fā)揮的作用,為尋找損傷心肌細胞的替代細胞提出新思路。通過組織塊培養(yǎng)法獲得狀態(tài)良好的原代hUC-MSCs,對其表面標志物進行鑒定,發(fā)現(xiàn)該細胞高表達CD44、CD90和CD105,不表達造血細胞標記CD34、CD45,表明該細胞具有MSCs的表型特征。本實驗根據前期工作制備了硬度分別為13-16kPa(軟)和62-68kPa(硬)的聚丙烯酰胺水凝膠(Polyacrylamide,PAAM),將P5或P6代次的hUC-MSCs接種在這兩種不同硬度基質上培養(yǎng)(day1、day7和day14),觀察細胞的行為學變化以及成心肌分化的能力。在不同基質硬度上,hUC-MSCs的細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化:細胞在軟基質上形態(tài)多呈現(xiàn)為短柱形,類似于肌細胞;而在硬基質上形態(tài)多呈現(xiàn)多角形,類似于成骨細胞。通過qPCR檢測在這兩種不同的基質硬度上早期心肌標志物Nkx2.5、GATA4、Mesp1以及成熟標志物cTnT、cTnI、α-actin的表達,結果顯示,在13-16kPa的基質硬度上,hUC-MSCs在第7天時均高表達早期以及成熟心肌標志物;通過Western Blot進一步檢測其蛋白水平的表達,除cTnT外,在13-16 kPa的基質硬度上心肌標志物同樣在第7天時高表達,表明13-16kPa的基質硬度上hUC-MSCs傾向于心肌方向分化。而在62-68kPa的基質硬度上,qPCR和Western Blot檢測結果顯示僅Nkx2.5和α-actin均在第七天時表達高過于對照組,且低于13-16kPa,表明62-68kPa的基質硬度對于hUC-MSCs向心肌方向分化的趨勢并不明顯。在基質硬度誘導人hUC-MSCs成心肌向分化的過程中,Piezo的表達發(fā)生變化。發(fā)現(xiàn)在第1天時Piezo1隨硬度增加表達量增加,而Piezo2雖然也有一定的變化,但是不具有規(guī)律性,因此,選擇Piezo1作為之后的研究對象。在同一時間點,在第1和7天,Piezo1隨基質硬度增加而升高,在14天軟基質明顯高于其余兩組;同一硬度上,Piezo1僅在第1天高表達,在13-16kPa基質硬度上Piezo1在隨時間表達趨于穩(wěn)定,在62-68kPa基質硬度上Piezo1隨時間表達逐漸降低。這說明在軟基質上Piezo1僅在第1天對于基質硬度敏感,在硬基質上Piezo1的敏感度持續(xù)時間更長。同時,檢測發(fā)現(xiàn)整合素β1和Ca~(2+)的表達也有明顯的變化,整合素β1和Ca~(2+)在軟基質上表達低于硬基質上。綜上所述,hUC-MSCs在硬度為13-16kPa的基質上傾向于心肌分化,而在62-68 kPa的基質上細胞向心肌方向分化的趨勢并不明顯。在此誘導分化過程中,Piezo1感知基質硬度的力學刺激,可能通過與整合素β1相互影響以及調節(jié)Ca~(2+)濃度來發(fā)揮作用。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

第 3 章 實驗結果第 3 章 實驗結果3.1 hUC-MSCs的培養(yǎng)與鑒定3.1.1 hUC-MSCs的原代培養(yǎng)從吉林大學第一附屬醫(yī)院獲得正常足月胎兒臍帶（經產婦本人同意），醫(yī)院倫理委員會獲準。通過組織塊培養(yǎng)法從臍帶華通膠組織中分離得到大量狀態(tài)良好的原代細胞。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)這些細胞大約在 5-10 天從組織塊爬出，剛開始細胞數(shù)量少，且形態(tài)不均一。隨著時間的推移，細胞逐漸增多，多呈現(xiàn)長梭形。隨著傳代的進行，發(fā)現(xiàn)獲得的細胞已經逐漸純化，得到的細胞的形態(tài)更加均一，當細胞融合至 80%以上，細胞呈旋渦狀或魚群狀。細胞傳至 P10 代之后，其生長緩慢，觀察其形態(tài)有分化的趨勢。因此，本實驗所用細胞的代次為 5-7 代。A B

第 3 章 實驗結果為驗證獲得的細胞是否符合國際細胞治療協(xié)會（ISCT）制定的 MSCs 鑒定最低標準，對獲得的細胞進行流式以及免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)該細胞高表達粘附性分子CD44，CD90和間充質干細胞標志物CD105，不表達表達造血細胞標記CD34，CD45，表明該細胞具有間充質干細胞的表型特性。

圖 3.3 hUC-MSCs向成脂成骨誘導分化（A） hUC-MSCs向成脂細胞分化油紅O染色。Scale bar=50μm（B） hUC-MSCs向成骨細胞分化茜素紅染色。Scale bar=50μm3.2 基質硬度的制備制備類心肌組織與類心肌纖維化組織硬度的聚丙烯酰胺水凝膠根據前期工作按照表 3.1 制備出 13-16kPa 和 62-68kPa 兩種不同硬度的聚丙烯酰胺水凝膠。本文是根據以往的文獻綜述進行總結才選擇實驗硬度為 13-16kPa（類似心肌組織）、62-68kPa（類似心肌纖維化組織）兩種基質凝膠作為實驗的基材。表 3.1 不同濃度的聚丙烯酰胺水凝膠的成分及比例硬度 丙烯酰胺 雙丙烯酰胺 催化劑13-16kPa 8% 0.1% AP、TEMED

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