發(fā)布時(shí)間：2020-09-21 22:14

　　 第一部分BCL3-PVRL2-TOMMM40基因簇單核苷酸多態(tài)性、基因-基因和基因-環(huán)境交互作用對血脂異常的影響背景:隨著物產(chǎn)資源的豐富,人們生活水平的提高,伴隨而來的心血管疾病發(fā)病人群的不斷增多,給世界各國的人民帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會負(fù)擔(dān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì),心血管疾病已成為全世界范圍內(nèi)人群發(fā)病致死的首要原因。引起心血管疾病的主要原因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化,而血脂異常是致動(dòng)脈粥樣硬化的重要原因,有效的防治血脂異常對減少動(dòng)脈粥樣硬化,乃至心血管疾病的防控工作具有決定性意義。根據(jù)近來的研究報(bào)告,血脂水平受多種因素的共同作用,其中環(huán)境因素、遺傳因素以及環(huán)境-遺傳因素相互作用的影響不可忽視。隨著研究的進(jìn)一步深入,幾宗大型全基因組關(guān)聯(lián)研究定位了一些新的、可能與血脂有關(guān)的基因,但這些基因與血脂水平的關(guān)系尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。其中有B細(xì)胞白血病/淋巴瘤-3基因(BCL3[MIM109560])、脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)基因-2(PVRL2[MIM600798])和外線粒體膜基因轉(zhuǎn)座酶基因(TOMM40 MIM[608061])等,它們與血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及總膽固醇(TC)的變化程度具有一定關(guān)聯(lián)。我國幅員遼闊,民族眾多,毛南族是55個(gè)少數(shù)民族其中之一,也是廣西壯族自治區(qū)特有的幾個(gè)少數(shù)民族之一。毛南族居住的地理環(huán)境、生活習(xí)性、飲食結(jié)構(gòu)、聚居特點(diǎn)都與本地居住的漢族居民存在差異。其族內(nèi)通婚的風(fēng)俗世代相傳,從而使其遺傳背景區(qū)別于當(dāng)?shù)氐臐h族,是研究群體遺傳作用、環(huán)境影響、基因-基因和基因-環(huán)境交互作用較為理想的族群。我們選擇了12個(gè)曾在歐洲人群為背景的研究中被證實(shí)與血脂有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn),這些位點(diǎn)均位于BCL3-PVRL2-TOMM40基因簇內(nèi)。通過基因分型,確定基因-基因,基因-環(huán)境的交互作用對毛南族人群血脂水平的影響,探討血脂異常發(fā)生的原因,為進(jìn)一步防治動(dòng)脈粥樣硬化乃至心血管病的發(fā)生發(fā)展具有重價(jià)意義。目的:了解廣西環(huán)江毛南族自治縣毛南族人群血脂水平分布情況及差異,分析血脂正常,異常兩組人群BCL3-PVRL2-TOMM40基因簇SNPs以及它們的單倍體與血脂水平的相關(guān)關(guān)系,探討性別、年齡、環(huán)境作用、遺傳因素以及環(huán)境-遺傳因素相互作用對血脂異常發(fā)生的影響。方法:按照國際流行病學(xué)同行的調(diào)查方法,對聚居于廣西西北部環(huán)江毛南族自治縣上南、中南和下南山區(qū)的毛南族居民進(jìn)行分層(性別和年齡)隨機(jī)抽樣,抽取祖宗三代均為毛南族并經(jīng)Y染色體和線粒體多樣性研究證實(shí)的居民作研究對象,記錄起居飲食習(xí)慣,身高體重等信息,并對研究者進(jìn)行研究相關(guān)的生活方式、既往發(fā)病情況的問卷調(diào)查和體格檢查。禁食12小時(shí)后,抽取靜脈血,部分血分離血清,用于測定甘油三酯(TG)、TC、HDLC、LDL-C,載脂蛋白(Apo)A1及Apo B水平,并計(jì)算Apo A1/Apo B比值。測量身高體重后計(jì)算體重指數(shù)(BMI)。安靜狀態(tài)下記錄血壓情況,記錄數(shù)據(jù)包括收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP),并計(jì)算脈壓差(PP)。另一部分血用于提取DNA,測定基因型。本研究在上述前期分層隨機(jī)抽樣調(diào)查完成的研究建立的標(biāo)本庫中隨機(jī)抽取毛南族1962人,根據(jù)2017中國成人血脂防治指南中血脂異常診斷標(biāo)準(zhǔn),將這兩組人群分為血脂正常組及血脂異常組。這兩組人群的性別和年齡構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)等方法對BCL3-PVRL2-TOMM40基因簇12個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(BCL3 rs2965101、rs4803748、rs2965169和rs8100239,PVRL2 rs10402271、rs3810143、rs519113、rs6859和rs283810,和TOMM40 rs157580、rs2070650和rs439401)進(jìn)行基因分型,用過Sanger測序,對PCR產(chǎn)物基因型結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。分析BCL3-PVRL2-TOMM40 SNPs各基因型及等位基因頻率在兩組人群,不同性別中的分布以及與血脂水平的關(guān)系。評估兩組人群的基因型,等位基因以及一些環(huán)境因素與血脂水平的相關(guān)性。為了分析基因遺傳因素對血脂異常的影響情況,計(jì)算各位點(diǎn)間的連鎖不平衡情況(LD)并以r2值或D'值進(jìn)行描述。構(gòu)建單倍體判斷基因間的交互情況,以上方法通過Haploview 4.2軟件分析并完成。為進(jìn)一步明確基因-基因和基因-環(huán)境交互作用對血脂異常發(fā)病的貢獻(xiàn)程度,用廣義多因子降維分析方法(GMDR)分析各位點(diǎn)與環(huán)境暴露因素之間的關(guān)系。結(jié)果:比較兩組人群的血脂水平后發(fā)現(xiàn),在血脂異常組中,BMI、吸煙和飲酒比率、空腹血糖、血清TC、TG和LDL-C水平高于正常組,而HDLC水平、Apo A1/Apo B比值在血脂異常組中低于正常組(P0.05-0.001)。兩組人群在年齡、性別、身高、BMI、腰圍(WC)、BP、DBP、PP、Apo A1和Apo B方面沒有觀察到差異(P0.05)。這兩組人群中的基因型和等位基因頻率存在差異(P0.05-0.001),且所有的基因突變均符合HardyWeinberg平衡(HWE,P0.05)。進(jìn)一步分析基因模型對血脂異常發(fā)病的影響后發(fā)現(xiàn),rs8100239和rs157580 SNPs的顯性模型對于血脂異常的發(fā)生具有保護(hù)作用,而rs10402271、rs3810143、rs519113和rs6859 SNPs的顯性模型則表現(xiàn)出增加患病做用(P0.05-0.001)。同時(shí),一些SNPs能引起相應(yīng)的血脂變化,在血脂異常組中的關(guān)系為:TC(rs2965101、rs4803748、rs2965169、rs8100239、rs519113、rs6859、rs157580、rs2075650和rs439401),TG(rs2965101、rs8100239、rs10402271、rs3810143、rs6859、rs283810和rs157580);LDL-C(rs2965101)。然而,在血脂正常組人群內(nèi)則觀察到的相關(guān)性為:TC(rs2965169、rs519113和rs157580);TG(rs2965101、rs8100239、rs6859和rs157580;P0.004-0.001)。多基因間連鎖不平衡(LD)分析闡明了在這兩組人群中,檢測位點(diǎn)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)的非獨(dú)立性。其中,最常見的單倍型是BCL3 A-C-A-T,PVRL2 A-A-GG-A和TOMM40 T-A-T(30%的比例)。攜帶BCL3 A-T-C-A、BCL3 AT-C-T、PVRL2 A-A-C-A-A、PVRL2 A-A-C-A-C、PVRL2 A-A-G-G-A、PVRL2C-G-C-A-A、PVRL2 C-G-C-A-C、TOMM40 C-A-C、TOMM40 C-A-T和TOMM40 T-A-T單倍型的比率在血脂異常和正常組人群之間存在差異。同時(shí),攜帶BCL3 A-T-C-A、PVRL2 A-A-C-A-C、PVRL2 A-A-G-G-A和TOMM40 T-A-T單倍型的人群能減少血脂異常的發(fā)病,而攜帶BCL3A-T-C-T、PVRL2 A-A-C-A-A、PVRL2 C-G-C-A-A、PVRL2 C-G-C-A-C、TOMM40 C-A-C和TOMM40 C-A-T單倍型則增加血脂異常的發(fā)病(P0.05-0.001)。進(jìn)一步研究基因-基因間的交互作用后發(fā)現(xiàn),最常見交互形式是A-C-A-T-A-A-G-G-A-T-A-T(15%的比例)。在兩組人群中,A-CA-T-A-A-G-A-A-T-A-T、A-C-A-T-A-A-G-G-A-C-A-C、A-C-A-T-A-AG-G-A-C-A-T、A-C-A-T-A-A-G-G-A-T-A-T、A-T-C-A-A-A-G-G-A-TA-T、G-T-C-A-A-A-G-A-A-C-A-C、G-T-C-A-A-A-G-G-A-C-A-C和G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T基因間相互作用的單倍型比例存在差異。同時(shí),攜帶A-C-A-T-A-A-G-A-A-T-A-T、A-T-C-A-A-A-G-G-A-TA-T和G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T的基因間相互作用單倍型具有保護(hù)作用,而A-C-A-T-A-A-G-G-A-C-A-C、A-C-A-T-A-A-GG-A-C-A-T、A-C-A-T-A-A-G-G-A-T-A-T、G-T-C-A-A-A-G-A-A-CA-C和G-T-C-A-A-A-G-G-A-C-A-C的交互效果則顯示出增加發(fā)病率的功能(P0.01-0.001)。為評估基因-基因和基因-環(huán)境之間的交互作用對血脂異常的影響,使用GMDR模型進(jìn)行分析,在調(diào)整協(xié)變量后(包括年齡、性別、BMI、血壓、血糖、吸煙和飲酒)分析結(jié)果得知:rs296510、rs157580和rs439401 SNPs之間存在SNP-SNP的相互作用,同時(shí)rs2965101、rs8100239 SNPs和BMI24 kg/m2存在潛在的SNP-環(huán)境相互作用。進(jìn)一步分析得知,單倍型-單倍型之間存在相互作用(PVRL2 AA-G-G-A,TOMM40 C-A-C和TOMM40 T-A-T)和單倍型-環(huán)境相互作用(TOMM40 C-A-C,TOMM40 T-A-T和BMI24 kg/m2,P0.001)。類似地,在兩組人群中亦能發(fā)現(xiàn)基因-基因相互作用(A-C-A-T-A-A-G-G-A-C-AC、A-C-A-T-A-A-G-G-A-T-A-T和G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T)和基因-環(huán)境相互作用(G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T,年齡75且BMI24 kg/m2)。為了明確這些交互作用對血脂異常發(fā)病帶來的影響,我們使用logistics回歸分析了其相互作用。我們發(fā)現(xiàn),與攜帶rs157580 CC和rs439401 TT基因型相比,攜帶rs157580 CT/TT和rs439401 CC/CT基因型的人群具有最低的血脂異�；疾★L(fēng)險(xiǎn)(校正OR=0.54,95%CI=0.32-0.93,P0.001)。當(dāng)考慮SNP-環(huán)境相互作用時(shí),我們發(fā)現(xiàn)攜帶rs2965101AC/CC基因型且BMI24 kg/m2的受試者增加血脂異常發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)(校正OR=1.08,95%CI=0.84-1.44,P=0.0015)。然而,當(dāng)分析單倍型-單倍型和單倍型-環(huán)境相互作用時(shí),我們可以發(fā)現(xiàn)PVRL2 A-A-C-A-A和TOMM40 C-A-C攜帶者(調(diào)整OR=5.47,95%CI=3.64-7.73,P0.001)和TOMM40 T-A-T攜帶者且BMI24kg/m2人群(校正OR=1.08,95%CI=0.75-1.54,P0.001)具有增加血脂異常的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)分析基因-基因和基因-環(huán)境相互作用時(shí),我們發(fā)現(xiàn)A-C-AT-A-A-G-G-A-T-A-T和G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T攜帶者能夠降低血脂異常風(fēng)險(xiǎn)(調(diào)整OR=0.88,95%CI=0.62-1.02,P0.001),而G-T-C-A-AA-G-G-A-T-A-T攜帶者且BMI24 kg/m2(校正OR=1.13,95%CI=0.85-1.49,P0.001)增加血脂異常發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)論:廣西毛南族血脂異常組與正常組之間不同類別血脂水平存在差異,血脂水平與年齡、性別、腰圍、血壓、血糖、抽煙及飲酒等因素密切相關(guān)。毛南族BCL3-PVRL2-TOMM40基因簇SNPs不同基因型和等位基因攜帶頻率與血脂異常水平存在關(guān)聯(lián),其單倍體攜帶情況在血脂異常和正常組中存在差異,且SNPs,單倍體與環(huán)境因素的相互作用也對患病風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生重要影響。第二部分加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析與高脂血癥相關(guān)的基因模塊和核心基因背景及目的:目前心血管疾病是全世界范圍內(nèi)引起患者的死亡的主要原因之一。近年來,隨著生活水平的提高,該病的發(fā)病率也逐年上升。高脂血癥是影響其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一,因此,預(yù)防高脂血癥對心血管疾病的控制有著舉足輕重的作用。根據(jù)現(xiàn)有的研究,高脂血癥的發(fā)生發(fā)展受環(huán)境因素、遺傳因素以及環(huán)境-遺傳因素相互作用的影響。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘,試圖尋找高脂血癥的潛在關(guān)鍵基因和發(fā)病途徑,并研究與其相關(guān)的可能機(jī)制。方法:近來,隨著基因芯片技術(shù)的不斷開發(fā),研究應(yīng)用十分廣泛,最主要的研究項(xiàng)目包括:基因表達(dá)譜測定、生物標(biāo)記物檢測、DNA序列測定、基因組文庫作圖及雜交測序、突變檢測、疾病分類和多態(tài)性分析等。國際上常用基因芯片數(shù)據(jù)庫主要有以下幾種:由美國國家生物信息學(xué)中心(NCBI)成立的Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫、國家基因組中心的資源建立的基于Internet的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫和英國的歐洲生物信息學(xué)中心建立的Arryexpress公共數(shù)據(jù)庫等。這些數(shù)據(jù)庫接收和保存全世界研究者提交的生物芯片數(shù)據(jù),研究人員可以根據(jù)研究內(nèi)容,選擇性的下載別人芯片的原始數(shù)據(jù)作進(jìn)一步的擴(kuò)展性分析,成為大數(shù)據(jù)挖掘的信息來源途徑之一。本研究在GEO數(shù)據(jù)庫中,下載GSE3059的芯片數(shù)據(jù),該數(shù)據(jù)包含13個(gè)已知的高脂血癥樣本�；蚬脖磉_(dá)網(wǎng)絡(luò)是一種通過無尺度找尋具有協(xié)同表達(dá)效果的基因,并組件共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模塊的方法。該方法能將一組具有相似功能、相近功能或者同時(shí)出現(xiàn)在某個(gè)特定生物學(xué)通路中的基因聚集在一起,成分一個(gè)模塊。研究人員則可根據(jù)某個(gè)未知功能的基因,出現(xiàn)所在的模塊情況,推斷該基因所具有的功能,同時(shí)也能進(jìn)一步擴(kuò)展推測其在模塊中具有相同功能基因間的相互調(diào)控關(guān)系,從而將模塊水平的探究和外在表型的關(guān)系聯(lián)系起來。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(weighted gene co-expression networks analyzed,WGCNA)算法是目前被廣泛應(yīng)用于國際生物學(xué)領(lǐng)域的一種構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的較為典型的生物學(xué)算法。進(jìn)一步對這模塊聚集到的基因進(jìn)行分析,通過使用R語言中cluster Profiler和DOSE包完成基因功能注釋(Gene Ontology annotation,GO)和京都基因和基因組途徑富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway enrichment analyses)。使用Cytoscape軟件建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),并使用MCODE插件檢測分析重要模塊。最后通過RT-PCR來對核心基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。結(jié)果:本研究通過WGCNA分析了這13個(gè)樣本基因-表型之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)基因在salmon-中心粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(R2=0.78,P0.01)和midnight blue-葡萄糖代謝(R2=0.67,P=0.01)兩個(gè)模塊具有最高的相關(guān)性。對這兩個(gè)模塊內(nèi)的基因進(jìn)行GO及KEGG分析發(fā)現(xiàn):Salmon模塊共有23個(gè)有意義的功能分析以及9條代謝相關(guān)通路;而Midnight blue模塊具有11個(gè)有意義的功能分析以及3條代謝相關(guān)通路。通過PPI及MCODE分析后,綜合判斷得到五個(gè)基因(組蛋白去乙�；�4,HDAC4;F2R胰蛋白酶相似物受-1,F2RL1;含水解酶結(jié)構(gòu)域-2,ABHD2;跨膜-4-六家族成-1,TM4SF1;以及家族序列相似性13-成員-A,FAM13A),這5個(gè)基因在高脂血癥的發(fā)生發(fā)展過程具有重要意義。當(dāng)用RT-q PCR驗(yàn)證時(shí),HDAC4的相對表達(dá)較低,但F2RL1、ABHD2、TM4SF1和FAM13A在高脂血癥中高于正常對照組(P0.05-0.01)。亞組分析顯示,毛南族HDAC4的相對表達(dá)量較低,而F2RL1和ABHD2的表達(dá)高于漢族(P0.05)。結(jié)論:HDAC4具有使組蛋白去乙�；淖饔�,結(jié)合生物信息學(xué)分析可知,除遺傳因素和環(huán)境暴露外,表觀遺傳影響(組蛋白修飾)影響高脂血癥發(fā)生和發(fā)展。毛南族人群高脂血癥的發(fā)生可能與組蛋白修飾(表觀遺傳調(diào)控)有關(guān),需要進(jìn)一步證實(shí)及驗(yàn)證。第三部分血液中mi R-3659水平作為肥胖患者血脂異常的潛在診斷生物標(biāo)志物的探討背景及目的:肥胖在現(xiàn)代社會發(fā)展中是個(gè)不可回避的話題,隨著對肥胖的研究深入,目前認(rèn)為這是一種慢性的代謝紊亂性疾病,涉及基因、體內(nèi)急速、環(huán)境影響等多種因素,其本質(zhì)特點(diǎn)為脂肪囤積,是一種能量過量的表現(xiàn)。隨著人們生活水平的不斷提高,食物的種類及烹飪方式較過去有明顯改善,近年來,人們花費(fèi)在吃上的錢明顯增多,但是愿意花費(fèi)時(shí)間在運(yùn)動(dòng)上的人群卻在減少,帶來的后果則是超重和肥胖的人越來越多。同時(shí),肥胖帶來的不僅僅只是影響容顏,更重要的它還是心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素,能引起血脂異常、高血壓、冠心病和糖尿病等多種代謝性疾病。有效的預(yù)防肥胖及其血脂異常的發(fā)生和發(fā)展能夠減少心腦血管疾病的發(fā)病率及病死率。最新的研究表明,肥胖能被表觀遺傳的作用所調(diào)控,故本研究試圖發(fā)現(xiàn)在肥胖人群中潛在引起血脂異常的關(guān)鍵基因,并通過生物信息學(xué)預(yù)測調(diào)控該基因的相關(guān)微小RNA(micro RNA),探討其在肥胖人群中對于血脂異常的發(fā)生發(fā)展所提供的預(yù)測價(jià)值。方法:近來,大數(shù)據(jù)挖掘已逐漸成為疾病研究的熱門技術(shù)�；蛐酒夹g(shù)能在疾病的基因譜上提供較多的信息,是疾病研究相關(guān)基因影響的一門重要技術(shù)。隨著基因芯片技術(shù)的不斷開發(fā),它能提供的研究項(xiàng)目包括:基因表達(dá)譜測定、生物標(biāo)記物檢測、DNA序列測定、基因組文庫作圖及雜交測序、突變檢測、疾病分類和多態(tài)性分析等。通常在完成芯片測序之后,會將相應(yīng)的數(shù)據(jù)上傳至指定數(shù)據(jù)庫,供后人下載和做進(jìn)一步研究分析,除了能夠節(jié)省相關(guān)經(jīng)費(fèi),也為課題的延續(xù)性做了良好的保證。目前能下載并使用的基因芯片數(shù)據(jù)庫包括:由美國國家生物信息學(xué)中心(NCBI)成立的Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫、國家基因組中心的資源建立的基于Internet的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫和英國的歐洲生物信息學(xué)中心建立的Arryexpress公共數(shù)據(jù)庫等。這些數(shù)據(jù)庫的建立大大的擴(kuò)充了信息數(shù)據(jù)的來源,已逐漸成為大數(shù)據(jù)挖掘不可缺少的工具。對于挖掘到的芯片數(shù)據(jù)分析,也有很多方法,研究者可以根據(jù)自己的研究需要選擇,而基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)是一種通過無尺度找尋具有協(xié)同表達(dá)效果的基因,并組件共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模塊的方法。該方法的核心思想為通過建立無尺度的相關(guān)性連接,將一組功能將近,或者集中在某個(gè)特定生物效應(yīng)通路中發(fā)揮作用的一些基因聚集成一個(gè)模塊,研究人員根據(jù)這些模塊與相關(guān)表型的相應(yīng)聯(lián)系推測這些基因的功能,甚至能預(yù)測這些基因是否具有相應(yīng)的調(diào)控關(guān)系的一種方法。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(weighted gene co-expression networks analyzed,WGCNA)算法是其中一種典型的生物信息學(xué)算法,它能構(gòu)建無尺度下根據(jù)基因與表型功能的權(quán)重構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),廣泛應(yīng)用于國際生物學(xué)領(lǐng)域中。本研究在GEO數(shù)據(jù)庫中,下載GSE66676的芯片數(shù)據(jù),該數(shù)據(jù)包含67個(gè)已知的肥胖個(gè)體,這些個(gè)體具有不同的血清血脂水平。通過分析,把這些在肥胖人群中引起血脂表型改變的基因聚集在某一模塊內(nèi),進(jìn)一步對模塊內(nèi)的基因進(jìn)行分析,使用R語言中cluster Profiler和DOSE包完成基因功能注釋(Gene Ontology annotation,GO)和京都基因和基因組途徑富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway enrichment analyses)。使用Cytoscape軟件建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),并使用MCODE插件檢測分析重要模塊。挑選到關(guān)鍵基因后,通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測與該基因具有調(diào)控作用的mi RNA,最后通過RT-PCR以及ROC曲線來對核心mi RNA進(jìn)行功能驗(yàn)證以及推斷其對血脂異常發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測價(jià)值。結(jié)果:本研究通過WGCNA分析了這67個(gè)樣本基因-表型之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)基因在grey60-甘油三酯水平(R2=0.98,P0.01)具有最高的相關(guān)性。對這個(gè)模塊內(nèi)的基因進(jìn)行GO及KEGG分析發(fā)現(xiàn)該模塊共有15個(gè)有意義的功能分析以及8條代謝相關(guān)通路。通過PPI及MCODE分析后,綜合判斷判定(膠原蛋白I型α1鏈,COL1A1)為核心基因。經(jīng)過生物信息學(xué)預(yù)測后得知:共有4個(gè)mi RNA(hsa-mi R-3659、hsa-mi R-4658、hsa-mi R-151a-5p和hsa-mi R-151b)能特異性的結(jié)合在該基因的3’UTR上。當(dāng)用RT-q PCR在血脂正常、異常組做驗(yàn)證時(shí),只有hsa-mi R-3659和hsa-mi R-151-5p具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步通過ROC曲線進(jìn)行分析,AUC hsa-mi R-3659=80.6%vs.AUC hsa-mi R-151-5p=76.9%(P0.05)。結(jié)論:COL1A1在肥胖人群中與血清甘油三酯水平呈正相關(guān),結(jié)合生物信息學(xué)分析可知,表觀遺傳影響(非編碼RNA)能特異性的結(jié)合該基因3’UTR上,影響血脂異常的發(fā)生,其中hsa-mi R-3659在肥胖人群中具有良好的血脂異常發(fā)病預(yù)測性,但具體的機(jī)制,需要進(jìn)一步證實(shí)及驗(yàn)證。第四部分全基因組DNA甲基化和基因表達(dá)譜聯(lián)合分析在冠心病發(fā)病機(jī)制中的作用背景及目的:目前冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病,CAD)仍是世界第一致死性疾病,其主要病變特點(diǎn)為動(dòng)脈粥樣硬化。引起CAD的原因很多,包括:年齡、性別、種族、高血壓、高血糖、血脂異常、高同型半胱氨酸、肥胖、基因背景差異和不良生活方式等。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),預(yù)計(jì)世界各國因CAD而致死的人數(shù)將從1990年的4700萬增加到2020年的8200萬。2010年Framingham的研究表明,CAD的發(fā)病情況因年齡而異,其中18-44歲、45-65歲和65歲以上人群的發(fā)病率分別為1.2%、7.1%和19.8%。在性別上,絕經(jīng)期前的女性發(fā)病率稍低,而絕經(jīng)后的女性發(fā)病率明顯升高。進(jìn)一步的研究顯示,在CAD人群中,其動(dòng)脈粥樣硬化斑塊富含脂質(zhì)泡沫細(xì)胞,為軟斑塊。此種軟斑塊進(jìn)展迅速,易破裂,是冠狀動(dòng)脈血栓形成的主要原因。CAD患者多無先兆癥狀,急性起病,多表現(xiàn)為急性冠脈綜合征,尤其是急性心肌梗死,病死率高。正常情況下,細(xì)胞是否能發(fā)揮某項(xiàng)特定的功能,是由細(xì)胞自身的基因表達(dá)譜所決定,經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為遺傳的分子基礎(chǔ)是核酸,不同生命間的遺傳信息均儲存在核苷酸的堿基序列上。隨著遺傳學(xué)的不斷進(jìn)步和發(fā)展,DNA甲基化水平、組蛋白、染色質(zhì)變異水平不同程度的修飾也會造成基因表達(dá)方式,表達(dá)數(shù)量的變化,并且這種改變是可以遺傳的。因此,表觀遺傳學(xué)的可定義為,在不改變基因序列的情況下,調(diào)控基因表達(dá),同時(shí)這種調(diào)控結(jié)果是可以通過細(xì)胞分裂的方式代代相傳的。與核苷酸序列多態(tài)性相反,表觀遺傳變異是特異性的,動(dòng)態(tài)的,甚至在整個(gè)生命過程中是可逆的,并且在機(jī)制上是多樣的。DNA甲基化、組蛋白質(zhì)修飾與非編碼RNA(nc RNA)調(diào)控這3個(gè)層面均能影響并調(diào)控基因表達(dá),是表觀遺傳學(xué)最重要的三個(gè)機(jī)制。因此,表觀遺傳學(xué)被認(rèn)為是基因型和個(gè)體表型之間的橋梁。DNA甲基化,是指甲基基團(tuán)在甲基化酶的作用下轉(zhuǎn)移到DNA的堿基序列上,使之發(fā)生甲基化修飾。DNA甲基化最常見的區(qū)域?yàn)榘奏ち姿猁}-鳥嘌呤(Cp G)島處,在人體細(xì)胞中,大約70%-80%DNA甲基化發(fā)生在整個(gè)基因組中的Cp G位點(diǎn)上,并受到DNA堿基序列和環(huán)境因素的共同作用發(fā)生變化。但隨著研究的不斷深入,許多非Cp G島部位的胞嘧啶在特定情況下也能發(fā)生甲基化修飾。尤其是在基因啟動(dòng)子區(qū),一旦胞嘧啶發(fā)生甲基化,基因特異性結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象改變,能持續(xù)性的阻止轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,或者通過重組染色質(zhì)來阻礙基因的表達(dá)。通過全基因DNA甲基化及表達(dá)譜聯(lián)合分析,不僅能發(fā)現(xiàn)致病基因內(nèi)在的致病機(jī)理,更能為CAD的治療提供足夠的參考依據(jù)。方法:疾病的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程,目前的芯片技術(shù)較以往逐漸成熟,但是單一芯片分析往往只能解釋疾病發(fā)生發(fā)展過程中一個(gè)層面的內(nèi)容,因此,多組學(xué),多樣本,多芯片的聯(lián)合分析已經(jīng)漸漸成為主流。本研究在GEO數(shù)據(jù)庫中,下載GSE23561以及GSE107143的芯片數(shù)據(jù)。GSE23561為表達(dá)譜芯片,內(nèi)含35人基因表達(dá)分析數(shù)據(jù),其中包含CAD 6人,健康對照組9。GSE107143為全基因組DNA基因甲基化分析芯片,內(nèi)含動(dòng)脈硬化患者8人,健康對照8人。兩塊芯片樣本來源均為外周血,且研究目的相近,樣本數(shù)量及年齡匹配,符合聯(lián)合分析條件。我們進(jìn)行了:(1)全基因組DNA甲基化和m RNA表達(dá)譜分析,分別篩選兩塊芯片的差異基因后,進(jìn)行比對,取交集后進(jìn)入下一階段;(2)使用R語言中cluster Profiler和DOSE包完成基因功能注釋(Gene Ontology annotation,GO)和京都基因和基因組途徑富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway enrichment analyses)。使用Cytoscape軟件建立蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),并使用MCODE插件檢測分析重要模塊。挑選到關(guān)鍵基因;(3)通過焦磷酸測序及RT-PCR技術(shù),在冠心病人群中對篩選到的11個(gè)不同甲基化位點(diǎn)及其相應(yīng)基因表達(dá)的驗(yàn)證試驗(yàn);(4)DNA甲基化與m RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析。結(jié)果:總共669個(gè)差異表達(dá)的m RNA與差異甲基化基因匹配。在疾病本體論,京都基因和基因組途徑百科全書,基因本體論,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊分析后,觀察到11個(gè)對應(yīng)于11個(gè)獨(dú)特基因的差異甲基化位置(DMP),它們分別是:BDNF-cg26949694、BTRC-cg24381155、CDH5-cg02223351、CXCL12-cg11267527、EGFR-cg27637738、IL-6-cg13104385、ITGB1-cg20545410、PDGFRB-cg25613180、PIK3R1-cg00559992、PLCB1-cg27178677和PTPRC-cg09247619。在對11個(gè)可能相關(guān)的DMP和相應(yīng)的基因表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證測試后,我們發(fā)現(xiàn)冠心病組中CXCL12的低甲基化程度較低,冠心病患者中ITGB1、PDGFRB和PIK3R1的相對表達(dá)較低,但僅有CXCL12和ITGB1甲基化呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:通過研究,我們確定了全基因組DNA甲基化程度與基因表達(dá)之間的相關(guān)性,甲基化程度影響基因表達(dá)譜的改變,并證明了CXCL12甲基化在冠心病發(fā)病機(jī)制中的重要作用。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R541.4;R589.2
【部分圖文】：

注：BMI=體重指數(shù)；TC=總膽固醇；TG=甘油三酯；HDL-C=高密度脂蛋白；LDL-C=低密度脂蛋白；ApoA1=載脂蛋白 A1；ApoB=載脂蛋白 B；ApoA1/ApoB=ApoA1 與 ApoB 的比值。3.2 PCR 產(chǎn)物電泳及限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果樣本基因組DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增后2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外光成像。在限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）反應(yīng)之后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳成像，根據(jù)酶限制性位點(diǎn)的存在和不存在標(biāo)記所鑒定的SNP的基因型，結(jié)果如圖3-1所示：TG（mmol/L） 1.23（0.81） 3.46（1.91） 214.26 2.00E-013HDL-C（mmol/L） 1.69±0.48 1.50±0.40 14.162 1.73E-004LDL-C（mmol/L） 2.76±0.77 3.48±0.97 17.218 3.50E-005ApoA1（g/L） 1.37±0.29 1.38±0.26 0.814 0.367ApoB（g/L） 0.82±0.19 1.10±0.20 0.178 0.673ApoA1/ApoB 1.73±0.53 1.29±0.42 38.512 6.62E-010

基因  環(huán)境交互及表觀遺傳作用對血脂異常及冠心病影響的相關(guān)研究 博士學(xué)位論文（I） PVRL2 rs283810 A > C, AA （ 5 and 6）, AC （ 1 and 2）, CC （ 3 and 4）, （J） TOMM40rs157580 C > T, CC （ 5 and 6）, CT （ 1 and 2）, TT （ 3 and 4）, （K） TOMM40 rs2075650 A >G, AA （ 5 and 6）, AG （ 1 and 2）, GG （ 3 and 4）, （L） TOMM40 rs439401 C > T, CC （ 5and 6）, CT （ 1 and 2）, TT （ 3 and 4）。當(dāng)DNA條帶＜100bp時(shí)，在凝膠上無法顯示。P1-P6: SNPs的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果，分別是 468-、 448-、541-、401-、390-、 430-、644-、 464-、382-、351-、493- and 222-bp。Figure 3-1 Single nucleotide polymorphism of BCL3-PVRL2-TOMM40 gene and restriction accountingendonuclease digestion product electrophoresis results.3.3 PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果通過 PCR-RFLP 檢測到的所有基因型，為保證分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，將酶切后產(chǎn)物經(jīng)過測序證實(shí)。通過 Sanger 測序，證實(shí)了限制性內(nèi)切酶基因分型的準(zhǔn)確性。圖 3-2 標(biāo)注了 12 個(gè) SNPs 在基因組上的相對位置，以及它們的測序結(jié)果。

圖 3-4 反應(yīng)了 BCL3-PVRL2-TOMM40 基因單核苷酸多態(tài)性基因型與血脂水平的存在關(guān)聯(lián)，并且因個(gè)體攜帶基因型最小等位基因的情況不同，在血脂異常組和血脂正常組中發(fā)揮著不同的作用。我們發(fā)現(xiàn)在血脂異常組中；rs2965101、rs4803748、rs2965169、rs8100239、rs519113、rs6859, rs157580、rs2075650 and rs439401 最小等位基因攜帶者能引起 TC 改變；rs2965101、rs8100239、 rs10402271、 rs3810143、 rs6859、 rs283810 and rs157580 最小等位基因攜帶者能引起 TG 突變；而 rs2965101 位點(diǎn)的突變則導(dǎo)致 LDL-C 的異常。在血脂正常組中也能發(fā)現(xiàn)類似的趨勢，rs2965169、rs519113 andrs157580 最小等位基因攜帶者引起 TC 改變，而 rs2965101、 rs8100239、rs6859 and rs157580 突變則改變血清 TG 的水平。（P < 0.05-0.001）。

本文編號：2824055