【研究背景】研究發(fā)現(xiàn)PTH誘導的End MT是介導CKD主動脈鈣化形成的重要機制之一,而PTH誘導End MT的機制目前仍不十分清楚。既往證據(jù)表明,PTH干預可上調(diào)Ephrin B2表達,而Ephrin B2/FAK信號通路參與上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化,但Ephrin B2/FAK信號通路是否參與介導End MT尚不明確。【研究方法】1.第一部分:Ephrin B2對PTH誘導HAECs發(fā)生End MT的影響。體外培養(yǎng)原代人主動脈內(nèi)皮細胞(HAECs):(1)分四組:1)PTH濃度為0mol/L的對照組2)PTH濃度為10-9 mol/L的干預組3)PTH濃度為10-8 mol/L的干預組4)PTH濃度為10-7mol/L的干預組,培養(yǎng)48h,real-time PCR、WB、共聚焦檢測Ephrin B2、End MT相關(guān)標志物的m RNA和蛋白的表達,WB檢測磷酸化Ephrin B2的表達;(2)細胞分為:1)PTH+錯義si RNA干預組(PTH 10-7mol/L+Vehicle)2)PTH+Ephrin B2si RNA干預組(PTH 10-7mol/L+si RNA),培養(yǎng)48h,檢測End MT相關(guān)標志物的m RNA和蛋白表達。2.第二部分:Ephrin B2是否通過激活FAK信號介導PTH誘導的End MT。(1)細胞分為四組:1)對照組(CTL組)2)PTH干預組(PTH 10-7mol/L)3)PTH+錯義si RNA干預組(PTH 10-7mol/L+Vehicle)4)PTH+Ephrin B2 si RNA干預組(PTH 10-7mol/L+si RNA)。培養(yǎng)48h,WB檢測FAK及磷酸化FAK表達水平,共聚焦檢測磷酸化FAK、CD31的表達。(2)細胞分為兩組:1)PTH+錯義si RNA干預組(PTH 10-7mol/L+Vehicle)2)PTH+FAK si RNA干預組(PTH10-7mol/L+si RNA),培養(yǎng)48h,檢測End MT相關(guān)標志物的表達�！狙芯拷Y(jié)果】1.第一部分:(1)PTH干預能夠呈濃度依賴性上調(diào)間充質(zhì)標志物FSP1和α-SMA的m RNA及蛋白水平,同時下調(diào)內(nèi)皮細胞標志物CD31和VE-Cadherin的m RNA和蛋白水平。PTH能夠呈濃度依賴性上調(diào)HAECs的Ephrin B2的蛋白水平及Ephrin B2的磷酸化水平。共聚焦結(jié)果示:對照組(CTL組)HAECs高表達內(nèi)皮細胞標志物CD31,少量表達Ephrin B2;而PTH干預組HAEC變纖長,有些細胞甚至失去CD31表達,但Ephrin B2表達增加。(2)與PTH+Vehi組細胞相比,PTH+Ephrin B2 si RNA干預組細胞的CD31和VE-Cadherinm RNA和蛋白表達上調(diào),FSP1和α-SMA的m RNA和蛋白表達水平明顯降低。2.第二部分:(1)PTH干預上調(diào)磷酸化FAK的水平,升高磷酸化FAK與FAK比值,但FAK的表達未明顯改變。與PTH+Vehi組細胞相比,PTH+Ephrin B2 si RNA干預組HAECs的磷酸化FAK蛋白表達水平明顯降低,磷酸化FAK與FAK比值亦明顯降低。共聚焦示:與CTL組相比,PTH+Vehi組細胞CD31的綠色熒光強度減弱,磷酸化FAK的紅色熒光強度明顯增強,Ephrin B2 si RNA干預后,磷酸化FAK紅色熒光強度較前減弱且CD31較PTH+Vehicle組增強。(2)與PTH+Vehicle組細胞相比,PTH+FAK si RNA干預組細胞的CD31、VE-Cadherin m RNA和蛋白表達水平上調(diào),FSP1和α-SMA的m RNA和蛋白表達水平明顯降低�！狙芯拷Y(jié)論】Ephrin B2/FAK信號徑路參與介導PTH誘導的人主動脈內(nèi)皮細胞的End MT,應用Ephrin B2 si RNA或FAK si RNA抑制該信號徑路的活化能夠部分阻斷PTH誘導的End MT相關(guān)標志物的表達。該研究結(jié)果有助于進一步闡明PTH促進End MT形成的機制,為臨床早期防治CKD血管鈣化供了新方向,同時也為認識EphrinB2/FAK信號通路在其它方面的作用供了思路。
【學位單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R543
【部分圖文】：

圖1 EphrinB2下游信號傳導圖示TH 可以上調(diào)小鼠骨髓基質(zhì)干細胞 EphrinB成骨細胞分化[13]。新的研究表明，EphrinB2未檢測到 EphrinB2 mRNA，而人腦海綿狀，該病變處的免疫組化示內(nèi)皮細胞 EphrinB信號的激活誘導 EndMT，這一過程中 Ephr腸癌的體外實驗表明 EphrinB2 磷酸化后通質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-to-mesenchymal transit維化及心臟纖維化的相關(guān)研究中，Ephrin-化、促進細胞外基質(zhì)的分泌[17-18]，而 EndM多。以上研究 示 Ephrin-B2 可能在 EndM景，本研究擬觀察 PTH 干預下人主動脈內(nèi)

東南大學碩士學位論文注：實時定量 PCR，n=3, *P＜0.05 vs. PTH 濃度為 0mol/L 對照組。。圖 1 PTH 對 HAECs EndMT 相關(guān)標志物 mRNA 表達的影響PTH（mol/L） 0 10-1010-910-810-7

5.2 PTH對內(nèi)皮細胞EphrinB2表達及磷酸化水平的影響：正常狀態(tài)下，EphrinB 家族中， EphrinB2 主要表達于 HAECs（見圖 3A不同濃度的 PTH（0，10-9，10-8，10-7mol/L）干預細胞 48h。Real-time PCR 顯示，PTH 能上調(diào) EphrinB2 mRNA 的表達，且 10-7mol/L 濃度干預下，上調(diào)顯著（見圖 3B）。Western Blot 結(jié)果顯示 PTH 能夠呈濃度依賴性上調(diào) HAE的 EphrinB2 的蛋白水平及 EphrinB2 的磷酸化水平（見圖 4）。且 PTH 濃度10-7mol/L 干預組，細胞內(nèi) EphrinB2 及磷酸化 EphrinB2 的蛋白水平與對照組比均出現(xiàn)顯著的統(tǒng)計學差異（*P＜0.05 vs. PTH 濃度為 0mol/L 對照組）。用10-7mol/L 濃度的 PTH 干預 HAECs 48 小時后，用共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)對照組（CTL 組）HAECs 高表達內(nèi)皮細胞標志物 CD31，少量表達 EphrinBPTH 干預組 HAEC 變纖長，有些細胞甚至失去 CD31 表達，且 EphrinB2 表達加（見圖 5）。以上 示 EphrinB2 信號蛋白的激活可能參與 PTH 誘導的 EndM

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1 吳

本文編號：2823571