目的:探討去泛素化酶BRCC36在小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)及心肌重構(gòu)中的作用及其作用機(jī)制。方法:1)通過商業(yè)化服務(wù)構(gòu)建心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)BRCC36的轉(zhuǎn)基因小鼠(α-MHC-BRCC36),利用PCR、Western blot方法進(jìn)行鑒定并篩選心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)BRCC36的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。2)取8-10周上述轉(zhuǎn)基因小鼠,采用結(jié)扎小鼠心臟左冠狀動(dòng)脈前降支(Left anterior coronary artery,LAD)的方法構(gòu)建心肌梗死模型,同時(shí)取8-10周野生型C57小鼠作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分組:野生假手術(shù)組(WTSham,n=15)、野生手術(shù)組(WTMI,n=47)、轉(zhuǎn)基因假手術(shù)組(TGSham,n=15)、轉(zhuǎn)基因手術(shù)組(TGMI,n=29)。3)心肌梗死模型構(gòu)建成功后繼續(xù)飼養(yǎng)4周,統(tǒng)計(jì)每組小鼠存活率;通過超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心臟功能;通過TTC染色檢測(cè)小鼠心臟梗死范圍。4)通過TUNEL染色方法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡比例,并通過Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。5)采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)的方法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)及骨膜蛋白(Periostin)的表達(dá)情況,并通過天狼猩紅染色、Masson三色法染色檢測(cè)LAD術(shù)后心肌纖維化的情況,通過Western blot方法檢測(cè)TGFβ信號(hào)通路中Smad3磷酸化情況及細(xì)胞外基質(zhì)中collage-Ⅲ的表達(dá)情況。6)通過Western blot檢測(cè)LAD術(shù)后DNA損傷標(biāo)志物γH2AX及DNA修復(fù)因子RAD51蛋白的變化情況。結(jié)果:1)通過PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠基因型進(jìn)行鑒定,篩選陽性小鼠,并通過Westernblot的方法檢測(cè)蛋白水平表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),基礎(chǔ)狀態(tài)下轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中BRCC36蛋白表達(dá)明顯增高。2)結(jié)扎小鼠左冠狀動(dòng)脈前降支,觀察小鼠心電圖,發(fā)現(xiàn)ST段顯著抬高。LAD術(shù)后28天,統(tǒng)計(jì)每組小鼠存活率發(fā)現(xiàn),與野生手術(shù)組小鼠相比,轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠存活率明顯增高(53.19%vs 79.31%)。通過TTC染色檢測(cè)小鼠LAD術(shù)后心肌缺血面積,發(fā)現(xiàn)與野生型手術(shù)組相比,轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠心肌缺血面積明顯減少。3)通過超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠LAD術(shù)后心臟功能,結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,手術(shù)組小鼠心臟左心室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular internaldimension systole,LVIDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(Left ventrcular internal diameter diastole,LVIDd)明顯增加,左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejcction fraction,LVEF)、短軸縮短率(shortening fraction,FS%)明顯降低,心臟功能明顯降低。與野生型手術(shù)組相比,轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠的心臟功能明顯改善。觀察每組小鼠LAD術(shù)后28天心臟大小,發(fā)現(xiàn)野生型手術(shù)組小鼠心臟比轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠心臟明顯增大。計(jì)算小鼠心臟體重比值發(fā)現(xiàn),野生型手術(shù)組小鼠的指標(biāo)比轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠明顯增大。4)通過天狼猩紅染色和masson三色法染色,檢測(cè)小鼠LAD術(shù)后小鼠心肌纖維化的情況,發(fā)現(xiàn)手術(shù)組小鼠心肌纖維化明顯加重,與野生型小鼠相比,轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠心肌纖維化明顯降低。通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timePCR)方法檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)、骨膜蛋白(Periostin)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)LAD術(shù)后小鼠細(xì)胞外基質(zhì)分子CTGF、Periostin的表達(dá)明顯增高,而轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)明顯低于野生型小鼠。Western blot檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白-Ⅲ(collage-Ⅲ)表達(dá)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因手術(shù)小鼠中collage-ⅢⅢ的表達(dá)明顯低于野生手術(shù)組,且P-Srmad3的表達(dá)也明顯低于野生手術(shù)組。5)通過TUNEL染色法檢測(cè)小鼠LAD術(shù)后心肌細(xì)胞凋亡的比例,結(jié)果顯示,LAD術(shù)后小鼠心肌細(xì)胞凋亡比例明顯增加,而與野生型手術(shù)組相比,轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠心肌細(xì)胞凋亡比例明顯低于野生型小鼠手術(shù)組。Western blot檢測(cè)凋亡蛋白發(fā)現(xiàn),LAD術(shù)后抗凋亡蛋白Bcl-2、P-Bad、Mcl-1的表達(dá)明顯降低,促凋亡蛋白Puma、caspase-3的表達(dá)明顯增高,而轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠抗凋亡蛋白的表達(dá)明顯高于野生型手術(shù)組小鼠,促凋亡蛋白的表達(dá)明顯低于野生型轉(zhuǎn)基因小鼠。6)為了檢測(cè)BRCC36對(duì)小鼠LAD術(shù)后心肌細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response,DDR)的影響,通過Western blot的方法檢測(cè)DNA損傷標(biāo)志物γH2AX及DNA損傷修復(fù)因子RAD51的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LAD術(shù)后小鼠心肌細(xì)胞DNA損傷標(biāo)志物γH2AX的表達(dá)明顯增高,DNA損傷修復(fù)因子RAD51的表達(dá)明顯降低,而與野生型手術(shù)組相比,轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠DNA損傷標(biāo)志物γH2AX的表達(dá)明顯降低,而DNA損傷修復(fù)因子RAD51的表達(dá)明顯增高。結(jié)論:心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)BRCC36可顯著改善心肌梗死后心臟病理性重構(gòu),改善心臟功能,這可能與其降低TGFβ誘導(dǎo)的Smad3磷酸化及促進(jìn)DNA損傷修復(fù)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

狀動(dòng)脈前降支構(gòu)建心肌梗死模型是目前研宄心肌梗死常用的實(shí)驗(yàn)方法，按照實(shí)驗(yàn)方法中構(gòu)逡逑建心肌梗死模型的方法構(gòu)建模型后，連接生物信號(hào)處理系統(tǒng)，檢測(cè)此時(shí)小鼠的心電圖，可逡逑以發(fā)現(xiàn)，野生手術(shù)組及轉(zhuǎn)基因手術(shù)組心電圖ＳＴ段明顯抬高，如圖２－Ａ所示，表明心肌梗逡逑死模型構(gòu)建成功。心肌梗死模型構(gòu)建成功后，每天觀察每組小鼠存活情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠逡逑死亡并進(jìn)行解剖確定小鼠死亡原因，記錄每組小鼠的生存死亡情況。繼續(xù)詞養(yǎng)２８天，發(fā)逡逑現(xiàn)手術(shù)組小鼠的死亡時(shí)間都集中在手術(shù)后第一周，一周后兩組小鼠都沒有在出現(xiàn)死亡，結(jié)逡逑果如圖２Ｂ所示，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠術(shù)后存活率明顯高于野生手術(shù)組（７９．３１邋％邋ｖｓ邋５３．１９％，逡逑Ｐ＜０．０５）。這個(gè)結(jié)果表明心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)ＢＲＣＣ３６可以明顯改善小鼠心肌梗死術(shù)后逡逑存活率。逡逑

圖２：檢測(cè)小鼠心肌梗死術(shù)后小鼠存活率。Ａ：檢測(cè)心肌梗死術(shù)后小鼠心電圖，發(fā)現(xiàn)手術(shù)組小鼠心電圖逡逑ＳＴ段明顯抬高。Ｂ：心肌梗死術(shù)后２８天，小鼠存活率的分析。ＷＴＭＩ野生手術(shù)組ｎ＝４７；邋ＴＧＭＩ轉(zhuǎn)基逡逑因手術(shù)組邋ｎ＝２９，邋＊邋Ｐ＜０．０５。逡逑３．３心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)ＢＲＣＣ３６減少小鼠心肌梗死后心肌梗死面積逡逑為了研究ＢＲＣＣ３６對(duì)心肌梗死小鼠模型心肌梗死面積的作用，我們?cè)谛募」Ｋ滥Ｐ蜆?gòu)逡逑建成功后繼續(xù)詞養(yǎng)２８天，麻醉處死小鼠，生理鹽水灌注，清洗心臟組織中的血液，取手逡逑術(shù)結(jié)扎部位以下心臟組織２ｍｍ厚度，放入預(yù)冷的生理鹽水中清洗。用ＰＢＳ配置１％的ＴＴＣ逡逑染料，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。使用前放入３７度溫箱中孵育１５ｍｉｎ，將清洗好的心臟組織放逡逑入１％的ＴＴＣ染料中，３７度避光孵育３０ｍｉｎ。孵育結(jié)束后將心臟組織放入４％的多聚甲醛逡逑中固定１小時(shí)�？梢园l(fā)現(xiàn)缺血梗死區(qū)域的心臟組織變白，而正常組織呈紅色。與假手術(shù)組逡逑相比，手術(shù)組小鼠都出現(xiàn)了明顯的梗死區(qū)域，但是與野生手術(shù)組相比，轉(zhuǎn)基因小鼠心肌梗逡逑死缺血區(qū)域明顯減少，這個(gè)結(jié)果表明心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)ＢＲＣＣ３６可以明顯縮小心肌梗逡逑死模型小鼠梗死區(qū)域面積。逡逑

圖４超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心肌梗死術(shù)后小鼠心臟功能。Ａ：心肌梗死術(shù)后小鼠超聲心動(dòng)圖代表圖；Ｂ－Ｅ：統(tǒng)逡逑計(jì)每組小鼠超聲心動(dòng)圖心臟功能指標(biāo)，ＬＶＩＤｄ：左心室舒張末期直徑；ＬＶＩＤｓ：左心室收縮末期直徑；逡逑ＦＳ：左心室短軸縮短率；ＬＶＥＦ：左心室射血分?jǐn)?shù)；Ｆ：各組小鼠心臟體重比值；Ｇ：各組小鼠心肌梗死逡逑術(shù)后整體觀。＊＊ｐ＜0．0ｌｖｓＷＴＳｈａｍ，邋＃ｐ＜０．０５ｖｓＷＴＭＩ。逡逑３．５心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)ＢＲＣＣ３６減輕小鼠心肌梗死術(shù)后心肌纖維化逡逑為了研究ＢＲＣＣ３６對(duì)心肌纖維化的影響，我們構(gòu)建心肌梗死模型成功后２８天將小鼠逡逑麻醉后處死小鼠，心臟灌流。留取結(jié)扎部位的左心室，４％的多聚甲醛固定，制作石蠟切片。逡逑通過天狼猩紅染色、ｍａｓｓｃｍ三色法染色檢測(cè)心肌纖維化的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相逡逑１：匕，心肌梗死術(shù)后小鼠心肌纖維化明顯加重，與野生型手術(shù)組小鼠相比，轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小逡逑鼠天狼猩紅染色、ｍａｓｓｏｎ三色法染色中心肌纖維化明顯減輕；通過ＲＴ－ＰＣＲ的方法檢測(cè)逡逑ＥＣＭ中ＣＴＧＦ、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因手術(shù)組小鼠細(xì)胞外基質(zhì)ＣＴＧＦ、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ逡逑的表達(dá)明顯低于野生型小鼠。同時(shí)通過ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法檢測(cè)心肌梗死術(shù)后心臟組織中逡逑ＢＲＣＣ３６蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)心肌梗死術(shù)后ＢＲＣＣ３６的表達(dá)明顯降低，而轉(zhuǎn)基因手術(shù)組逡逑小鼠ＢＲＣＣ３６的表達(dá)明顯高于野生型手術(shù)組小鼠；同時(shí)檢測(cè)ＴＧＦ（３信號(hào)通路中Ｓｍａｄ３的逡逑

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本文編號(hào)：2823221