第一部分Vaspin對TNF-α誘導的H9C2細胞損傷的影響及機制目的1.研究TNF-α對H9C2細胞損傷作用及其機制。2.研究vaspin對TNF-α誘導的H9C2細胞損傷的影響及機制。方法1.TNF-ɑ誘導H9C2細胞損傷模型的建立。探索不同時間TNF-ɑ對H9C2細胞的影響,實驗分組:(1)Control組:正常(21%O_2、5%CO_2、74%N_2,37℃)條件培養(yǎng)H9C2細胞24 h;(2)TNF-ɑ4 h組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入TNF-α(20ng/ml)培養(yǎng)4 h;(3)TNF-ɑ12 h組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入TNF-α(20 ng/ml)培養(yǎng)12 h;(4)TNF-ɑ24 h組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入TNF-α(20 ng/ml)培養(yǎng)24 h;光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變;Western blot觀察各組LC3、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表達相對變化。2.研究TNF-ɑ誘導的自噬和凋亡的因果關系,通過干預自噬觀察細胞凋亡的變化。實驗分組:(1)Control組:正常(21%O_2、5%CO_2、74%N_2,37℃)條件培養(yǎng)H9C2細胞24 h;(2)TNF-α組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入TNF-α(20 ng/ml)培養(yǎng)24 h;(3)TNF-α+雷帕霉素(rapamycin,Rap)組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入Rap(100 nm)預處理2 h,再加入TNF-α(20 ng/ml)培養(yǎng)24 h;(4)TNF-α+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入3-MA(5 mm)預處理2 h,再加入TNF-α(20 ng/ml)培養(yǎng)24 h;光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變;Western blot觀察各組LC3、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表達相對變化;AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。3.研究vaspin對TNF-α誘導的H9C2細胞損傷的影響。實驗分組:(1)Control組:正常(21%O_2、5%CO_2、74%N_2,37℃)條件培養(yǎng)H9C2細胞24 h;(2)Vaspin組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入vaspin(100 ng/ml)培養(yǎng)24 h;(3)TNF-α組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入TNF-α(20 ng/ml)培養(yǎng)24 h;(4)TNF-α+vaspin組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入vaspin(100 ng/ml)預處理2 h,再加入TNF-α(20 ng/ml)培養(yǎng)24 h;(5)TNF-α+vaspin+IGF-1組:H9C2細胞培養(yǎng)基中加入vaspin(100 ng/ml)預處理2 h,IGF-1(100 ng/ml)預處理3 h,再加入TNF-α(20 ng/ml)培養(yǎng)24 h;利用MTT檢測和ATP檢測評估細胞活性;Western blot觀察各組LC3、Beclin-1、Bax、Bcl-2、p-AKT、p-mTOR、AKT、mTOR蛋白表達相對變化;電鏡和MDC染色觀察細胞自噬小體的數(shù)量變化;AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。結果1.TNF-ɑ誘導H9C2細胞發(fā)生凋亡同時伴有自噬水平降低。光學顯微鏡顯示,對照組H9C2細胞呈“長梭形”貼壁生長,TNF-α組細胞形態(tài)不規(guī)則,培養(yǎng)基上清中出現(xiàn)透亮的漂浮死細胞,且隨誘導時間延長,漂浮細胞數(shù)目增多;與對照組相比,TNF-α誘導后,H9C2細胞內凋亡蛋白Bax的表達隨時間逐漸上升,抗凋亡蛋白Bcl-2表達逐漸下調(P0.05);Beclin-1蛋白表達隨時間逐漸下降,而自噬底物P62蛋白表達逐漸上升,同時表示自噬流的LC3-II/LC3-I的比值隨時間逐漸下降(P0.05);2.上調自噬抑制TNF-α誘導的H9C2細胞凋亡。相比TNF-α組,TNF-α+Rap組凋亡蛋白Bax表達下調,抗凋亡蛋白Bcl-2表達上調(P0.05);而TNF-α+3-MA組凋亡蛋白Bax表達上調,抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(P0.05);細胞流式實驗顯示:與Control組相比,TNF-α組細胞凋亡率增加(P0.05);與TNF-α組相比,TNF-α+Rap組細胞凋亡率減少,而TNF-α+3-MA組細胞凋亡率增加(P0.05);3.Vaspin抑制TNF-α誘導的H9C2細胞凋亡。相比TNF-α組,vaspin預處理使細胞活性明顯增加,細胞內ATP含量明顯增加,且濃度大于100 ng/ml差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01);Western blot提示:相比TNF-α組,TNF-α+vaspin組Bax/Bcl-2比值顯著下降(P0.05);細胞流式實驗顯示,與Control組相比,vaspin組細胞凋亡率無明顯變化(P0.05),而TNF-α組細胞凋亡率增加(P0.05);與TNF-α組相比,TNF-α+vaspin組細胞凋亡率減少(P0.05);4.Vaspin促進H9C2細胞自噬。相比Control組,vaspin組細胞Beclin-1蛋白表達上調,LC3-II/LC3-I比值上升(P0.01);而TNF-α組細胞Beclin-1蛋白表達下調,LC3-II/LC3-I比值下降(P0.01);相比TNF-α組,TNF-α+vaspin組細胞Beclin-1蛋白表達上調,且LC3-II/LC3-I比值上升(P0.01);透射電鏡實驗及MDC實驗顯示,相比Control組,vaspin組細胞內自噬體數(shù)目明顯增多,而TNF-α組細胞內自噬小體數(shù)目減少(P0.05);相比TNF-α組,TNF-α+vaspin組細胞內自噬小體數(shù)目增多(P0.05);5.Vaspin通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路促進自噬減少細胞凋亡。相比Control組,vaspin組細胞LC3-II蛋白表達水平上調,LC3-I表達水平下調,LC3-II/LC3-I比值上升,p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值下降(P0.01)而Bax/Bcl-2比值無明顯變化(P0.05)TNF-α組細胞LC3-II蛋白表達水平下調,p-AKT蛋白表達上調,LC3-II/LC3-I比值下降,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和Bax/Bcl-2比值上升(P0.01);相比TNF-α組,TNF-α+vaspin組LC3-II/LC3-I比值上升,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和Bax/Bcl-2比值下降(P0.01)相比TNF-α+vaspin組,TNF-α+vaspin+IGF-1組LC3-II/LC3-I比值下降,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和Bax/Bcl-2比值上升(P0.01)結論1.TNF-α可通過抑制自噬誘導H9C2細胞的凋亡。2.Vaspin通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路促進自噬減少細胞凋亡。第二部分Vaspin對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化及心功能的影響目的探討vaspin對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化及心功能的影響。方法取10周雄性SD大鼠隨機分為以下3組:(1)對照組:普通飼料飼養(yǎng),腹腔注射生理鹽水(0.5 ml/kg/day);(2)DCM組:一次性腹腔注射鏈脲霉素(Streptozotocin,STZ)(60 mg/kg)制作糖尿病模型,2周后尾靜脈采血檢測血糖高于16.7 mmol/l表示糖尿病模型建模成功,模型成功后腹腔注射生理鹽水(0.5 ml/kg/day),繼續(xù)喂養(yǎng)12周;(3)Vaspin組:糖尿病模型成功后腹腔注射vaspin(320 ng/kg/day),繼續(xù)喂養(yǎng)12周,進行以下實驗:(1)實驗前一天,應用心臟彩超測量各組大鼠左室舒張末徑(LVIDd)、左室收縮末徑(LVIDs)、左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)和E峰/A峰(Em/Am)變化并比較分析;(2)頸靜脈竇采血檢測各組大鼠血液中TNF-α的變化;(3)HE染色觀察各組大鼠心肌組織結構變化;(4)Masson染色檢測各組大鼠心肌膠原纖維含量并分析膠原容積分數(shù);(5)Western blot測定各組大鼠心肌組織中LC3、Beclin-1、P62、Bax、Bcl-2、TGF-β1、Collagen I蛋白表達相對變化。結果:1.相比Control組,DCM組體重降低,空腹血糖升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);相比DCM組,vaspin組體重增加,空腹血糖降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);2.相比Control組,DCM組TNF-α升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);相比DCM組,vaspin組TNF-α無顯著變化(P0.05);3.相比Control組,DCM組LVEF、FS、Em/Am降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);相比DCM組,vaspin組LVEF、FS、Em/Am升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);4.相比Control組,DCM組LC3-II/LC3-I、Bcelin-1表達水平降低,P62、Bax/Bcl-2表達水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);相比DCM組,vaspin組LC3-II/LC3-I、Bcelin-1升高,P62、Bax/Bcl-2表達水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);5.HE染色顯示,DCM組心肌結構排列紊亂,vaspin處理后明顯改善;Masson染色顯示,相比于DCM組,vaspin組心肌膠原容積分數(shù)減小(P0.05);Western blot提示vaspin能減少I型膠原蛋白的表達(P0.01),而對TGF-β1的表達無明顯影響(P0.05)。結論Vaspin可增加糖尿病心肌病大鼠心肌組織中的自噬水平,抑制心肌纖維化及改善糖尿病心肌病大鼠的心功能。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2;R542.2
【部分圖文】：

(8) 透射電鏡觀察，拍片。1.16 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)分析及繪制統(tǒng)計圖表均采用 GraphPad prism 6.0 統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（ x ±s）表示，各組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，采用 t 檢驗比較兩組之間的差異；多組比較時，采用單因素方差分析（ANOVA）比較整體是否有差異，之后采用 Holm Sidak 法比較兩兩間的差異，P㩳0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。2.結果2.1 TNF-α誘導 H9C2 細胞凋亡2.1.1 形態(tài)學改變光學顯微鏡下顯示，對照組 H9C2 細胞呈現(xiàn)“長梭形”貼壁生長。TNF-α組細胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)透亮的漂浮死細胞，且隨誘導時間延長死細胞增多（圖 2-1）。

A B圖 2-2 TNF-α誘導 H9C2 細胞凋亡 A. TNF-α不同時間誘導的 Bax 和 Bcl-2 蛋白表達相對性變化 B. 以β-actin 為內參，標準化處理后蛋白灰度比值的相對變化（con 表示 Control,*P<0.05, **P<0.01 vs. Control, n=6）2.2 TNF-α抑制 H9C2 細胞自噬相比 Control 組，TNF-α誘導后，H9C2 細胞內 Beclin-1 蛋白的表達隨時間延長而逐漸下降，而自噬底物 P62 蛋白的表達隨時間延長而逐漸上升，同時表示自噬流的 LC3-II/LC3-I 的比值隨時間而逐漸下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05)(圖 2-3)。

A B圖 2-2 TNF-α誘導 H9C2 細胞凋亡 A. TNF-α不同時間誘導的 Bax 和 Bcl-2 蛋白表達相對性變化 B. 以β-actin 為內參，標準化處理后蛋白灰度比值的相對變化（con 表示 Control,*P<0.05, **P<0.01 vs. Control, n=6）2.2 TNF-α抑制 H9C2 細胞自噬相比 Control 組，TNF-α誘導后，H9C2 細胞內 Beclin-1 蛋白的表達隨時間延長而逐漸下降，而自噬底物 P62 蛋白的表達隨時間延長而逐漸上升，同時表示自噬流的 LC3-II/LC3-I 的比值隨時間而逐漸下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05(圖 2-3)。

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本文編號：2823069