缺氧(hypoxia)是指因組織的氧氣供應不足或用氧障礙,導致組織的代謝、功能和形態(tài)結構發(fā)生異常變化的病理過程。大量研究表明,缺氧可導致心室重塑。心室重塑的病理學特征為心肌細胞肥大、心肌成纖維細胞增殖、間質纖維化、心肌細胞死亡等。人們對慢性長期缺氧加速心室重塑的細胞與分子生物學機制進行了深入系統(tǒng)的研究,部分揭示了缺氧導致心肌結構重構、電重構的病理生理學機制。大量證據(jù)表明,代謝重構(亦稱代謝重編程)在缺氧引發(fā)心室重塑中發(fā)揮重要作用,但目前缺氧造成代謝重構的確切機制尚不十分清楚。microRNA(miRNA)是一種非編碼的小RNA,它調(diào)控基因的轉錄后表達。研究證明,有多種miRNAs在心室代謝重塑中起重要作用。miR-155作為miRNA家族的一員,已被報道參與調(diào)控心血管疾病的炎癥反應,調(diào)控血管重塑。但miR-155在缺氧引起的心肌代謝重塑的分子機制還未被報道,本研究著重對miR-155在心室代謝重塑中的作用及其分子機制做了初步研究。第一部分慢性缺氧誘導的心代謝重塑模型構建目的:研究慢性缺氧引起的心臟結構和功能改變。方法:1.心臟超聲檢測正常小鼠與缺氧小鼠心功能變化。2.心臟HE染色觀察正常與缺氧小鼠心臟組織學改變。3.天狼星紅染色及心臟組織的α肌動蛋白(α-actin)和膠原蛋白I型α2鏈(Col1a2)免疫雙熒光染色觀察兩組小鼠心臟內(nèi)膠原含量變化。4.實時定量PCR(qRT-PCR)、Western Blot檢測葡萄糖轉運蛋白-1(GLUT1)的表達變化。5.液質聯(lián)用方法檢測心臟組織中乳酸和丙酮酸含量。結果:1.慢性缺氧誘導小鼠心肌肥厚與正常小鼠相比,缺氧后小鼠心率加快,左室收縮、舒張末期內(nèi)徑減小,心功能減弱,室壁厚度增加。2.慢性缺氧導致心肌細胞形態(tài)異常心臟HE染色結果顯示,缺氧后小鼠心肌細胞發(fā)生腫脹,空泡樣變增加,心肌間隙增加,說明缺氧造成心肌損傷。3.慢性缺氧導致心肌纖維化心臟內(nèi)膠原含量的多少可以反映心臟纖維化情況。天狼星紅染色及膠原蛋白I型α2鏈免疫熒光實驗均顯示小鼠缺氧后心臟組織內(nèi)膠原含量增加,說明缺氧誘導心肌纖維化。4.慢性缺氧促進心肌組織攝取葡萄糖葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)是葡萄糖轉運的主要載體,可間接代表葡萄糖攝取情況。qRT-PCR、Western Blot及免疫熒光染色均顯示,缺氧小鼠心臟中GLUT1的表達明顯增加。5.慢性缺氧促進心肌組織糖酵解進程液質聯(lián)用方法檢測正常與缺氧小鼠心臟組織中丙酮酸和乳酸含量,結果顯示,缺氧后小鼠的心臟組織中丙酮酸和乳酸含量增加,說明缺氧誘導葡萄糖的利用并促進有氧氧化轉變?yōu)樘墙徒�。小結:慢性缺氧誘導心室結構改變,促進心臟組織的糖酵解。第二部分miR-155介導缺氧誘導的心肌成纖維細胞代謝重編程目的:探討miR-155在慢性缺氧誘導的心肌成纖維細胞代謝重編程中的作用及其分子機制。方法:1.MTT檢測缺氧對心肌成纖維細胞增殖的影響。2.葡萄糖攝取實驗檢測缺氧對心肌成纖維細胞葡萄糖攝取的影響。3.Western Blot檢測常氧組和缺氧組細胞GLUT1的表達。4.液質聯(lián)用方法檢測正常與缺氧細胞培養(yǎng)基中丙酮酸及乳酸濃度。5.Real-time PCR檢測缺氧后細胞內(nèi)miR-155的表達。6.qRT-PCR檢測缺氧對miR-155~(WT)與miR-155~(-/-)小鼠心肌成纖維細胞GLUT1、丙酮酸脫氫酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶的表達的影響。7.糖原染色檢測缺氧對miR-155~(WT)與miR-155~(-/-)小鼠心肌成纖維細胞糖原積累的影響。結果:1.慢性缺氧促進小鼠心肌成纖維細胞增殖原代小鼠心肌成纖維細胞,分別進行常氧和缺氧處理,MTT結果顯示,缺氧促進小鼠心肌成纖維細胞增殖。2.慢性缺氧促進心肌成纖維細胞攝取葡萄糖葡萄糖攝取實驗顯示,慢性缺氧促進心肌成纖維細胞攝取葡萄糖。另外,缺氧組GLUT1的mRNA和蛋白的水平也顯著增加,提示缺氧促進細胞對葡萄糖的攝取和轉運。3.慢性缺氧促進心肌成纖維細胞糖酵解進程液質聯(lián)用方法結果顯示,缺氧的心肌成纖維細胞培養(yǎng)基中丙酮酸、乳酸濃度均增加,提示缺氧誘導葡萄糖的利用并由有氧氧化轉變?yōu)樘墙徒�。為了進一步驗證上述結論,我們檢測了糖酵解代謝關鍵酶丙酮酸脫氫酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶的表達。結果顯示,缺氧顯著誘導丙酮酸脫氫酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶在心肌成纖維細胞中的表達。4.缺氧下調(diào)miR-155的表達為了進一步研究缺氧誘導心肌成纖維細胞代謝重編程的分子機制,缺氧培養(yǎng)原代小鼠心肌成纖維細胞,Real-time檢測miR-155的表達,結果顯示,缺氧顯著降低miR-155在心肌成纖維細胞中的表達。5.敲除miR-155,促進心肌成纖維細胞增殖為了進一步明確miR-155在缺氧誘導的心肌成纖維細胞代謝重編程中的作用,我們?nèi)毖跖囵B(yǎng)miR-155~(WT)和miR-155~(-/-)小鼠心肌成纖維細胞,MTT檢測miR-155對兩組細胞增殖的影響,結果顯示,缺氧顯著誘導miR-155~(-/-)組心肌成纖維細胞增殖。6.敲除miR-155,促進心肌成纖維細胞攝取葡萄糖為了進一步明確miR-155促進心肌成纖維細胞增殖是否與促進葡萄糖攝取有關,我們進一步檢測了GLUT1的表達。結果顯示,缺氧顯著誘導miR-155~(-/-)組小鼠心肌成纖維細胞組對葡萄糖的攝取。7.敲除miR-155,心肌成纖維細胞中糖原合成減少、糖酵解增強糖原染色結果證明,與對照組相比,miR-155~(-/-)組在缺氧后糖原積累減少;qRT-PCR結果顯示缺氧后,敲除miR-155促進丙酮酸脫氫酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶等表達,提示敲除miR-155,心肌成纖維細胞糖酵解增強。小結:慢性缺氧促進心肌成纖維細胞增殖,下調(diào)心肌成纖維細胞中miR-155表達。敲除miR-155,促進慢性缺氧心肌成纖維細胞的增殖及糖酵解。結論:1.慢性缺氧下調(diào)miR-155在心肌成纖維細胞中的表達。2.敲除miR-155,促進缺氧誘導的心肌成纖維細胞代謝重編程。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

圖 1 慢性缺氧導致心肌細胞形態(tài)異常 Chronic hypoxia led to abnormal cardiomyocyte morp(HE staining).缺氧導致心肌纖維化維化是心肌重塑的一種結構改變。天狼星紅染色結組織內(nèi)膠原含量顯著增加（Fig. 2A）。膠原蛋白的表達情況可以間接反應纖維化的程度。心臟組織氧小鼠心臟組織 Col1a2 表達增加（Fig. 2B）。以致心肌纖維化。

圖 2 慢性缺氧導致心肌纖維化 Chronic hypoxia led to myocardial fibrosis. (A) Sirius red staining. (Bunofluorescence for Col1a2 (red), α-actin (green), and DAPI (blue) inse heart with normoxia or hypoxia4. 慢性缺氧促進心肌組織攝取葡萄糖葡萄糖轉運蛋白（GLUT）家族，特別是 GLUT1 和 GLUT3 已經(jīng)被公是主要的葡萄糖轉運蛋白。為了進一步研究缺氧是否引起心肌組織代構，我們檢測了心肌組織 GLUT1 的表達。Real-time PCR 結果顯示，顯著誘導心肌組織表達 GLUT1，為常氧組的 1.5 倍(Fig. 3A)。Westernting (Fig. 3B-C)和間接免疫熒光 (Fig. 3D)結果顯示，缺氧顯著誘導小臟組織中 GLUT1 的表達。以上結果表明，慢性缺氧促進心肌組織攝萄糖。

圖 3 慢性缺氧促進 GLUT1 的表達3 Chronic hypoxia promoted the expression of GLUT1. (A) GLUT1ession was detected by qRT-PCR in the mouse heart. ***P<0. 001 vs.rol group.(B-C) The expression of GLUT1 was detected by Western blot.0.05 vs. control group.(D) Immunofluorescence for GLUT1 (green), andI (blue) in mouse heart5. 慢性缺氧促進心肌組織糖酵解心肌細胞是高能量需求細胞，富含線粒體（占細胞體積的 35%），氧化磷酸化產(chǎn)生的 ATP 維持心肌細胞的鈣依賴性收縮。缺氧導致線氧化磷酸化功能受限，勢必將代謝從線粒體氧化磷酸化調(diào)整為糖酵在低氧條件下，保證 ATP 的產(chǎn)生。因此，我們進一步檢測了缺氧心織中乳酸含量，監(jiān)測糖酵解水平。液質聯(lián)用結果顯示，缺氧小鼠心臟中乳酸(Fig. 4A)及丙酮酸(Fig. 4B) 含量均顯著增加，提示，慢性缺氧心肌組織糖酵解。

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本文編號：2813399