發(fā)布時(shí)間：2020-09-07 13:27

　　 缺氧(hypoxia)是指因組織的氧氣供應(yīng)不足或用氧障礙,導(dǎo)致組織的代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的病理過程。大量研究表明,缺氧可導(dǎo)致心室重塑。心室重塑的病理學(xué)特征為心肌細(xì)胞肥大、心肌成纖維細(xì)胞增殖、間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞死亡等。人們對(duì)慢性長期缺氧加速心室重塑的細(xì)胞與分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究,部分揭示了缺氧導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)的病理生理學(xué)機(jī)制。大量證據(jù)表明,代謝重構(gòu)(亦稱代謝重編程)在缺氧引發(fā)心室重塑中發(fā)揮重要作用,但目前缺氧造成代謝重構(gòu)的確切機(jī)制尚不十分清楚。microRNA(miRNA)是一種非編碼的小RNA,它調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。研究證明,有多種miRNAs在心室代謝重塑中起重要作用。miR-155作為miRNA家族的一員,已被報(bào)道參與調(diào)控心血管疾病的炎癥反應(yīng),調(diào)控血管重塑。但miR-155在缺氧引起的心肌代謝重塑的分子機(jī)制還未被報(bào)道,本研究著重對(duì)miR-155在心室代謝重塑中的作用及其分子機(jī)制做了初步研究。第一部分慢性缺氧誘導(dǎo)的心代謝重塑模型構(gòu)建目的:研究慢性缺氧引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能改變。方法:1.心臟超聲檢測正常小鼠與缺氧小鼠心功能變化。2.心臟HE染色觀察正常與缺氧小鼠心臟組織學(xué)改變。3.天狼星紅染色及心臟組織的α肌動(dòng)蛋白(α-actin)和膠原蛋白I型α2鏈(Col1a2)免疫雙熒光染色觀察兩組小鼠心臟內(nèi)膠原含量變化。4.實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)、Western Blot檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(GLUT1)的表達(dá)變化。5.液質(zhì)聯(lián)用方法檢測心臟組織中乳酸和丙酮酸含量。結(jié)果:1.慢性缺氧誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚與正常小鼠相比,缺氧后小鼠心率加快,左室收縮、舒張末期內(nèi)徑減小,心功能減弱,室壁厚度增加。2.慢性缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞形態(tài)異常心臟HE染色結(jié)果顯示,缺氧后小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生腫脹,空泡樣變?cè)黾?心肌間隙增加,說明缺氧造成心肌損傷。3.慢性缺氧導(dǎo)致心肌纖維化心臟內(nèi)膠原含量的多少可以反映心臟纖維化情況。天狼星紅染色及膠原蛋白I型α2鏈免疫熒光實(shí)驗(yàn)均顯示小鼠缺氧后心臟組織內(nèi)膠原含量增加,說明缺氧誘導(dǎo)心肌纖維化。4.慢性缺氧促進(jìn)心肌組織攝取葡萄糖葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體,可間接代表葡萄糖攝取情況。qRT-PCR、Western Blot及免疫熒光染色均顯示,缺氧小鼠心臟中GLUT1的表達(dá)明顯增加。5.慢性缺氧促進(jìn)心肌組織糖酵解進(jìn)程液質(zhì)聯(lián)用方法檢測正常與缺氧小鼠心臟組織中丙酮酸和乳酸含量,結(jié)果顯示,缺氧后小鼠的心臟組織中丙酮酸和乳酸含量增加,說明缺氧誘導(dǎo)葡萄糖的利用并促進(jìn)有氧氧化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒狻Ｐ〗Y(jié):慢性缺氧誘導(dǎo)心室結(jié)構(gòu)改變,促進(jìn)心臟組織的糖酵解。第二部分miR-155介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞代謝重編程目的:探討miR-155在慢性缺氧誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞代謝重編程中的作用及其分子機(jī)制。方法:1.MTT檢測缺氧對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響。2.葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)檢測缺氧對(duì)心肌成纖維細(xì)胞葡萄糖攝取的影響。3.Western Blot檢測常氧組和缺氧組細(xì)胞GLUT1的表達(dá)。4.液質(zhì)聯(lián)用方法檢測正常與缺氧細(xì)胞培養(yǎng)基中丙酮酸及乳酸濃度。5.Real-time PCR檢測缺氧后細(xì)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)。6.qRT-PCR檢測缺氧對(duì)miR-155~(WT)與miR-155~(-/-)小鼠心肌成纖維細(xì)胞GLUT1、丙酮酸脫氫酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶的表達(dá)的影響。7.糖原染色檢測缺氧對(duì)miR-155~(WT)與miR-155~(-/-)小鼠心肌成纖維細(xì)胞糖原積累的影響。結(jié)果:1.慢性缺氧促進(jìn)小鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖原代小鼠心肌成纖維細(xì)胞,分別進(jìn)行常氧和缺氧處理,MTT結(jié)果顯示,缺氧促進(jìn)小鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖。2.慢性缺氧促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞攝取葡萄糖葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)顯示,慢性缺氧促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞攝取葡萄糖。另外,缺氧組GLUT1的mRNA和蛋白的水平也顯著增加,提示缺氧促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。3.慢性缺氧促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞糖酵解進(jìn)程液質(zhì)聯(lián)用方法結(jié)果顯示,缺氧的心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中丙酮酸、乳酸濃度均增加,提示缺氧誘導(dǎo)葡萄糖的利用并由有氧氧化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒狻榱诉M(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論,我們檢測了糖酵解代謝關(guān)鍵酶丙酮酸脫氫酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶的表達(dá)。結(jié)果顯示,缺氧顯著誘導(dǎo)丙酮酸脫氫酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。4.缺氧下調(diào)miR-155的表達(dá)為了進(jìn)一步研究缺氧誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞代謝重編程的分子機(jī)制,缺氧培養(yǎng)原代小鼠心肌成纖維細(xì)胞,Real-time檢測miR-155的表達(dá),結(jié)果顯示,缺氧顯著降低miR-155在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。5.敲除miR-155,促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖為了進(jìn)一步明確miR-155在缺氧誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞代謝重編程中的作用,我們?nèi)毖跖囵B(yǎng)miR-155~(WT)和miR-155~(-/-)小鼠心肌成纖維細(xì)胞,MTT檢測miR-155對(duì)兩組細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,缺氧顯著誘導(dǎo)miR-155~(-/-)組心肌成纖維細(xì)胞增殖。6.敲除miR-155,促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞攝取葡萄糖為了進(jìn)一步明確miR-155促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖是否與促進(jìn)葡萄糖攝取有關(guān),我們進(jìn)一步檢測了GLUT1的表達(dá)。結(jié)果顯示,缺氧顯著誘導(dǎo)miR-155~(-/-)組小鼠心肌成纖維細(xì)胞組對(duì)葡萄糖的攝取。7.敲除miR-155,心肌成纖維細(xì)胞中糖原合成減少、糖酵解增強(qiáng)糖原染色結(jié)果證明,與對(duì)照組相比,miR-155~(-/-)組在缺氧后糖原積累減少;qRT-PCR結(jié)果顯示缺氧后,敲除miR-155促進(jìn)丙酮酸脫氫酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶等表達(dá),提示敲除miR-155,心肌成纖維細(xì)胞糖酵解增強(qiáng)。小結(jié):慢性缺氧促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖,下調(diào)心肌成纖維細(xì)胞中miR-155表達(dá)。敲除miR-155,促進(jìn)慢性缺氧心肌成纖維細(xì)胞的增殖及糖酵解。結(jié)論:1.慢性缺氧下調(diào)miR-155在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。2.敲除miR-155,促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞代謝重編程。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

圖 1 慢性缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞形態(tài)異常 Chronic hypoxia led to abnormal cardiomyocyte morp(HE staining).缺氧導(dǎo)致心肌纖維化維化是心肌重塑的一種結(jié)構(gòu)改變。天狼星紅染色結(jié)組織內(nèi)膠原含量顯著增加（Fig. 2A）。膠原蛋白的表達(dá)情況可以間接反應(yīng)纖維化的程度。心臟組織氧小鼠心臟組織 Col1a2 表達(dá)增加（Fig. 2B）。以致心肌纖維化。

圖 2 慢性缺氧導(dǎo)致心肌纖維化 Chronic hypoxia led to myocardial fibrosis. (A) Sirius red staining. (Bunofluorescence for Col1a2 (red), α-actin (green), and DAPI (blue) inse heart with normoxia or hypoxia4. 慢性缺氧促進(jìn)心肌組織攝取葡萄糖葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）家族，特別是 GLUT1 和 GLUT3 已經(jīng)被公是主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。為了進(jìn)一步研究缺氧是否引起心肌組織代構(gòu)，我們檢測了心肌組織 GLUT1 的表達(dá)。Real-time PCR 結(jié)果顯示，顯著誘導(dǎo)心肌組織表達(dá) GLUT1，為常氧組的 1.5 倍(Fig. 3A)。Westernting (Fig. 3B-C)和間接免疫熒光 (Fig. 3D)結(jié)果顯示，缺氧顯著誘導(dǎo)小臟組織中 GLUT1 的表達(dá)。以上結(jié)果表明，慢性缺氧促進(jìn)心肌組織攝萄糖。

圖 3 慢性缺氧促進(jìn) GLUT1 的表達(dá)3 Chronic hypoxia promoted the expression of GLUT1. (A) GLUT1ession was detected by qRT-PCR in the mouse heart. ***P<0. 001 vs.rol group.(B-C) The expression of GLUT1 was detected by Western blot.0.05 vs. control group.(D) Immunofluorescence for GLUT1 (green), andI (blue) in mouse heart5. 慢性缺氧促進(jìn)心肌組織糖酵解心肌細(xì)胞是高能量需求細(xì)胞，富含線粒體（占細(xì)胞體積的 35%），氧化磷酸化產(chǎn)生的 ATP 維持心肌細(xì)胞的鈣依賴性收縮。缺氧導(dǎo)致線氧化磷酸化功能受限，勢必將代謝從線粒體氧化磷酸化調(diào)整為糖酵在低氧條件下，保證 ATP 的產(chǎn)生。因此，我們進(jìn)一步檢測了缺氧心織中乳酸含量，監(jiān)測糖酵解水平。液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果顯示，缺氧小鼠心臟中乳酸(Fig. 4A)及丙酮酸(Fig. 4B) 含量均顯著增加，提示，慢性缺氧心肌組織糖酵解。

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本文編號(hào)：2813399