研究背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction)已經(jīng)成為危害人類健康的一大殺手。目前,自體干細(xì)胞移植在心肌梗死后的心肌組織修復(fù)和再生中發(fā)揮著重要的作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作為干細(xì)胞移植治療,修復(fù)梗死心肌優(yōu)選的一類供體細(xì)胞,它具有自我更新及多向分化的潛能,同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子以維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)并修復(fù)損傷組織。然而研究證實(shí),相對(duì)于年輕個(gè)體來(lái)源的MSCs,老年個(gè)體來(lái)源的MSCs呈現(xiàn)衰老表型,生物學(xué)功能降低,導(dǎo)致移植后心肌修復(fù)的效果都顯著下降。因此,如何改善老年MSCs的衰老及其心肌修復(fù)能力成為亟待解決的問(wèn)題。有研究表明,人胎兒組織中分離的MSCs在體外培養(yǎng)的條件上清中含有生物活性因子可以降低老年MSCs衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性,增強(qiáng)老年MSCs細(xì)胞增殖和成骨分化潛能,提示人胎兒組織來(lái)源的MSCs可以通過(guò)釋放旁分泌因子發(fā)揮抗衰老作用。外泌體(exosomes)是一種細(xì)胞外囊泡,可攜帶多種內(nèi)含物包括核酸、蛋白、脂質(zhì)、mRNAs和microRNAs等。Exosomes可以延緩受損組織進(jìn)一步損傷,同時(shí)可以加強(qiáng)組織修復(fù)進(jìn)程。既往研究顯示在大鼠心肌梗死模型中,MSCs來(lái)源的exosomes預(yù)處理的心臟祖細(xì)胞具有更好的存活率,能促進(jìn)心梗周邊毛細(xì)血管密度增加,心臟纖維化減少,并恢復(fù)長(zhǎng)期的心臟功能。提示我們exosomes在MSCs的旁分泌中起了重要的作用,但年輕個(gè)體來(lái)源的MSCs分泌的exosomes對(duì)老年MSCs的作用尚不清楚,機(jī)制尚待明確。研究目的:人臍帶組織來(lái)源的MSCs(UMSCs)分泌的exosomes是否可以改善老年人MSCs(OMSCs)的衰老表型,提高老年人MSCs對(duì)心梗小鼠的心肌修復(fù)能力及其作用機(jī)制研究。研究方法和結(jié)果:1.本研究首先比較了比較OMSCs(60歲)與UMSCs的衰老表型和生物功能活性。結(jié)果顯示OMSCs的增殖、遷移、抗凋亡能力明顯下降。證實(shí)不同年齡段MSCs功能存在差異。2.從UMSCs培養(yǎng)條件上清中提取exosomes,通過(guò)體外用UMSCs來(lái)源的exosomes處理OMSCs,觀察其是否能改善OMSCs的衰老表型及生物學(xué)功能。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UMSCs來(lái)源的exosomes能降低OMSCs衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性,降低衰老相關(guān)因子的表達(dá),如:p51、p21和p16,增強(qiáng)老年MSCs的增殖、遷移、分化潛能、抗凋亡及旁分泌功能。證實(shí)UMSCs分泌的exosomes可改善OMSCs的衰老。3.通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)篩選出衰老相關(guān)microRNAs,比較U]MSCs、OMSCs和經(jīng) UMSCs 來(lái)源 exosomes 處理過(guò)的 OMSCs 及 UMSCs、OMSCs 分泌的 exosomes中特異miRNAs的表達(dá)差異,通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)UMSCs和經(jīng)exosomes處理過(guò)的OMSCs中含有更高水平的miR-136以及下調(diào)的下游基因apaf1。進(jìn)一步明確UMSCs分泌的exosomes中攜帶有抗衰老因子。4.體外通過(guò)分別在OMSCs和UMSCs中添加miR-136 mimic和inhibitor,觀察UMSCs來(lái)源的exosomes是否通過(guò)miR-136能改善OMSCs的生物功能和衰老表型。明確miR-136在exosomes改善OMSCs衰老中的重要作用。5.體內(nèi)構(gòu)建小鼠心梗模型,將DMEM,OMSCs,UMSCs和經(jīng)exosomes處理過(guò)的OMSCs經(jīng)心肌內(nèi)注射移植入小鼠心臟,以便觀察不同處理后的OMSC其對(duì)心梗后心肌修復(fù)的差異。分析心梗后3、7、14、28天的小鼠心臟的血管新生,心臟纖維化,心功能等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)相對(duì)于未處理的OMSCs,經(jīng)UMSCs來(lái)源的exosomes處理過(guò)的OMSCs更明顯地改善心功能。結(jié)論:人臍帶組織MSCs(UMSCs)來(lái)源的exosomes能明顯改善老年人MSCs(OMSCs)的衰老表型,提高老年MSCs對(duì)心梗小鼠的心肌修復(fù)能力,且通過(guò)exosomes內(nèi)的miR-136抑制下游基因apaf1發(fā)揮抗衰老作用。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

圖３．１邋ＭＳＣｓ和ｅｘｏｓｏｍｅｓ的鑒定

臍帶來(lái)源ＭＳＣｓ邋（ＵＭＳＣｓ）和老年人骨髓來(lái)源ＭＳＣｓ邋（ＯＭＳＣｓ）的ＳＡ－（３－ｇａｌ活性。逡逑相比臍帶來(lái)源的ＭＳＣｓ，老年人來(lái)源ＭＳＣｓ的ＳＡ－ｐ－ｇａｌ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和染色強(qiáng)度均逡逑明顯增加（圖３．２Ａ－Ｂ）。同時(shí)我們還比較了邋ＳＩＲＴ１和ｐ２１在ＵＭＳＣｓ與ＯＭＳＣｓ逡逑細(xì)胞中的蛋白水平。相比于ＵＭＳＣｓ，邋ＳＩＲＴ１在ＯＭＳＣｓ中表達(dá)水平和活性都有明逡逑顯的下降，ｐ２１在ＯＭＳＣｓ中表達(dá)水平和活性明顯上升（圖３．２Ｃ－Ｄ）。此外，我們逡逑用細(xì)胞增殖曲線法分析相同培養(yǎng)代數(shù)的ＵＭＳＣｓ與ＯＭＳＣｓ的增殖差異。我們發(fā)現(xiàn)，逡逑ＯＭＳＣｓ的生長(zhǎng)相對(duì)于ＵＭＳＣｓ的生長(zhǎng)明顯緩慢（圖３．２Ｅ）。逡逑Ｉ０６－逡逑Ｉ邋＞４．逡逑－邐Ｄ叫邐Ｅ逡逑ＵＭＳＣｓ邐ＯＭＳＣｓ邐Ｉ！，。邐丁逡逑．邐｜邐一邋—邐４－，邋？邋ＯＭＳＣｓ（ｎ＝６）逡逑Ｓ｜ｒｔｌ邋產(chǎn)d叔危殄澹殄澹沖澹擔(dān)危澹眨停櫻茫螅ǎ睿劍叮╁澹苠義希劍劍劍劍劍村巍危常危危義希校玻卞澹逡誨澹澹逡誨�？逦工邋￣￣E危插危剩椋掊義希牽粒校模儒危恚恚潁鑠澹恚礤味皰

本文編號(hào)：2809285