冠狀動脈微栓塞(Coronary Microembolization,CME)被認為是經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)的主要并發(fā)癥之一。CME會導致冠脈慢血流或無復流,CME還會導致心臟收縮功能障礙和心律失常。因此,CME的發(fā)生與心肌梗死面積的進展和患者病情預后的惡化程度密切相關。近年來,微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)與CME期間心肌的凋亡和自噬密切相關;然而,其中的潛在機制尚未完全闡明。miRNA是18-24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA,可以通過與靶mRNA的3’-UTR成對結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控靶基因的表達。由于一個miRNA可以靶向多個基因,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA可以參與調(diào)節(jié)多種生化和生理活動。越來越多的證據(jù)表明,miRNA具有診斷和治療心血管疾病的潛力。缺氧可嚴重改變心肌細胞的miRNA表達譜。以往的研究也報道過自噬與大多數(shù)心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展相關。然而,在早期心肌缺氧時,心肌細胞的自噬激活相關研究目前尚未報道。在之前的一項研究中,我們發(fā)現(xiàn),在心梗后,大鼠心肌細胞中有幾種miRNA明顯下調(diào),其中一個miRNA是miR-30e-5p。這是一種可能參與心肌細胞凋亡和自噬的miRNA。miR-30家族最近被報道參與自噬調(diào)控。然而,miR-30e-5p在CME后心肌細胞凋亡和自噬過程中的作用尚不清楚。心肌細胞屬于不可再生細胞,由于心臟樣本獲得的困難和人心肌細胞難以培養(yǎng),一直以來阻礙著心肌細胞相關研究的進展。目前,大多數(shù)研究報告都是利用動物模型來模擬心血管疾病。然而,動物和人類心臟組織之間存在著重要的生物學和病理學差異,尤其是在心肌細胞中。近年來,人源多潛能干細胞來源心肌細胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)已成為研究心血管疾病的一個理想模型。hiPSC-CMs的產(chǎn)生為體外直接評估心肌細胞功能提供了一個創(chuàng)新的方法。因此,我們利用一種新的hiPSC-CMs模型來模擬CME期間缺氧誘導損傷的發(fā)展。進一步研究miR-30e-5p對hiPSC-CM凋亡和自噬影響的機制。第一部分hiPSC-CMs的獲得目的:將人源多潛能干細胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化為hiPSC-CMs,并鑒定其心肌特性和純度。方法:體外培養(yǎng)將hiPSCs分化為心肌細胞,觀察hiPSCs的形態(tài);采用細胞免疫熒光技術鑒定hiPSC-CMs的特性;利用流式細胞技術檢測其純度。結(jié)果:傳代hiPSCs后細胞呈集落樣生長,當匯合度達90%左右時,用試劑盒分化hiPSCs,分化至第10天左右可見成片的自主跳動的hiPSC-CMs,將成片的hiPSC-CMs消化為單個細胞后再接種,繼續(xù)培養(yǎng)至40天。心肌鈣蛋白T(cTnT)特異性標記心肌,利用細胞免疫熒光技術檢測hiPSC-CMs的特異性,可見40天的hiPSC-CMs具有結(jié)構分明且成熟的肌絲和Z帶結(jié)構。細胞流式實驗結(jié)果顯示分化hiPSC-CMs的純度高達85%。第二部分miR-30e-5p在缺氧誘導hiPSC-CMs的凋亡中的表達水平下調(diào)目的:通過建立hiPSC-CMs缺氧模型,探索hiPSC-CMs缺氧模型中miR-30e-5p表達水平的變化及凋亡水平。方法:按缺氧時間的長短分組為0h、6h、12h、16h、20h、24h組,每組獨立重復3次。將hiPSC-CMs置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)構建缺氧模型。應用RT-qPCR檢測hiPSC-CMs中miR-30e-5p的表達水平,應用Caspase-3活性實驗檢測hiPSC-CMs的凋亡水平。結(jié)果:1.與缺氧0h組相比,缺氧12h、16h、20h、24h組hiPSC-CMs的miR-30e-5p表達水平顯著下調(diào)(P0.05)。2.與缺氧0h組相比,缺氧24h組hiPSC-CMs的Caspase-3活性顯著上調(diào)(P0.05)。結(jié)論:miR-30e-5p在缺氧誘導的hiPSC-CMs凋亡過程中的表達水平下調(diào)。第三部分miR-30e-5p靶向BIM抑制缺氧誘導hiPSC-CMs凋亡目的:研究miR-30e-5p與缺氧誘導hiPSC-CMs凋亡的關系,探討miR-30e-5p靶向BIM調(diào)控缺氧誘導hiPSC-CMs凋亡的作用。方法:將40天hiPSC-CMs分為正常組(N)、缺氧組(H)、過表達對照組(NC+H)、miR-30e-5p過表達組(miR+H)。N組置于正常培養(yǎng)箱下培養(yǎng);H組置于缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;NC+H組與miR+H組分別為穩(wěn)定感染裝載有miR-NC和miR-30e-5p的重組慢病毒后缺氧處理24h。應用RT-qPCR檢測hiPSC-CMs中miR-30e-5p和BIM的mRNA表達水平,應用Caspase-3活性實驗和流式細胞技術檢測hiPSC-CMs的凋亡水平。應用鈣熒光技術檢測hiPSC-CMs的鈣瞬變水平,應用Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及靶蛋白BIM的表達水平。利用生物信息學miRNA數(shù)據(jù)庫預測miR-30e-5p的靶基因,并應用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。結(jié)果:1.與N組比較,H組miR-30e-5p表達水平明顯下調(diào);與NC+H組比較,miR+H組miR-30e-5p表達水平則明顯上調(diào)。2.與N組比較,H組Caspase-3活性水平明顯升高;與NC+H組比較,miR+H組Caspase-3活性水平下降。3.與N組比較,H組hiPSC-CMs凋亡比例明顯上升;與NC+H組比較,miR+H組hiPSC-CMs凋亡比例則明顯下降。4.與N組比較,H組hiPSC-CMs鈣瞬變的振幅下降和衰減時間延長;與NC+H組比較,miR+H組hiPSC-CMs鈣瞬變的振幅提高和衰減時間縮短。5.與N組比較,H組凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3表達水平上調(diào);與NC+H組比較,miR+H組凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3表達水平下調(diào)。6.與N組比較,H組蛋白BIM表達水平上調(diào);與NC+H組比較,miR+H組蛋白BIM表達水平下調(diào)。7.通過miRNA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)BIM是miR-30e-5p的潛在靶基因之一;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-30e-5p能與BIM的3′UTR序列直接結(jié)合從而導致熒光素酶活性降低;相反,對應的BIM 3′UTR突變結(jié)合位點對熒光素酶活性沒有影響。結(jié)論:1.miR-30e-5p調(diào)控缺氧誘導hiPSC-CMs的凋亡。2.BIM是miR-30e-5p的靶基因之一。3.miR-30e-5p靶向BIM調(diào)控缺氧誘導hiPSC-CMs的凋亡。第四部分BIM介導自噬抑制缺氧誘導hiPSC-CMs的凋亡目的:探討B(tài)IM調(diào)控缺氧誘導hiPSC-CMs的凋亡的作用機制。方法:檢測NC+H組和miR+H組的自噬相關蛋白Beclin-1和p62的表達水平,將40天hiPSC-CMs分為對照shRNA+H組(shNC+H)與shRNA BIM+H組(shBIM+H),shNC+H組與shBIM+H組分別為穩(wěn)定感染裝載有對照shRNA和BIM shRNA的重組慢病毒后缺氧處理24h。應用Caspase-3活性實驗和流式技術檢測hiPSC-CMs的凋亡水平。應用鈣熒光技術檢測hiPSC-CMs的鈣瞬變水平,應用Western blot檢測靶蛋白BIM、凋亡蛋白Caspase-3、自噬相關蛋白Beclin-1和p62的表達水平。結(jié)果:與NC+H組相比,miR+H組的自噬相關蛋白Beclin-1和p62的表達水平上升。經(jīng)過下調(diào)BIM表達水平后,與shNC+H組相比,shBIM+H組的Caspase-3活性、心肌細胞凋亡比例、凋亡蛋白Caspase-3下降,而自噬相關蛋白Beclin-1和p62的表達水平上升。結(jié)論:BIM通過介導自噬抑制缺氧誘導hiPSC-CMs的凋亡。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R541.4
【部分圖文】：

22圖 1 hiPSC-CMs 的分化及鑒定A: hiPSCs 在低倍鏡下明場的集落樣形態(tài)；B: hiPSCs 分化第 10 天時，成片狀的 hiPSC-CMs 形態(tài)；C:消化成單個細胞再接種后 hiPSC-CMs 的形態(tài)；D: hiPSC-CMs 的心肌特異性鑒定（紅色為 Z 帶、綠色為肌絲）。E: hiPSC-CMs 分化的純度。Figure1 differentiation and identification of hiPSC-CMs (A) The colony-like morphology of the bright fieldof hiPSCs The morphology of 10-day hiPSC-CMs (C) The hiPSC-CMs were digested into individual cells(D) Immunostaining of hiPSC-CMs after 40 days of differentiation and culture: α-actinin (red), cTnT(green), DAPI (blue). (E) Representative flow cytometry result showing the efficiency of hiPSC-CMdifferentiation.

30e-5p 靶向 BIM 調(diào)控缺氧誘導人源多潛能干細胞來源心肌細胞凋亡的作用及機制研究 2019 屆碩士研究生學實驗結(jié)果1 miR-30e-5p 表達水平將 40 天的 hiPSC-CMs 分別進行 0h、6h、12h、16h、20h、24h 不的缺氧處理，與缺氧 0h 組相比，缺氧 12h、16h、20h、24h 組 hiPSC- miR-30e-5p 表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）。

C-CMs 的 Caspase-3 活性水平。t of hiPSC-CM viability using Caspase-3 activity miR-30 家族中的一員，它包含了 md 和 miR-30e 五個獨立的 miRNA。mi泛參與多種心血管疾病的發(fā)病機制[28-3力衰竭、心肌梗死、心肌肥厚及缺血/再明 miR-30 家族在心肌缺血損傷[33]的保p 在缺氧后 hiPSC-CMs 損傷中的具體作通過構建 hiPSC-CMs 缺氧模型，miR-30e-5p 表達水平從缺氧 12h 開始

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本文編號：2809109