【摘要】：目的:本研究通過制備清道夫受體啟動子連接兔基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrixmetalloproteinase 9 MMP9)的結(jié)構(gòu)基因,應(yīng)用原核顯微注射技術(shù)來制作巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)MMP9的轉(zhuǎn)基因家兔模型來研究動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生。通過體內(nèi)實驗分析巨噬細(xì)胞由來的MMP9在動脈硬化斑塊形成及發(fā)展病理過程中的作用。體外實驗觀察在MMP9過表達(dá)的HepG2細(xì)胞內(nèi),前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素 9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9),低密度脂蛋白受體(Low density lipoprotein Receptor,LDLR)基因表達(dá)的變化水平,揭示MMP9,PCSK9和LDLR三者之間的相互作用關(guān)系以及它們對脂質(zhì)代謝的影響。方法:本研究將日本大耳白兔的MMP9 cDNA導(dǎo)入含有清道夫受體啟動子的pAL-1載體內(nèi),并在結(jié)構(gòu)兩端安插絕緣子,使其不受插入染色體位置的影響,在動物體內(nèi)得到穩(wěn)定的巨噬細(xì)胞特異性MMP9的高表達(dá)。將構(gòu)建好的MMP9基因直接注射到受精卵的雄原核內(nèi),然后將帶有MMP9基因的受精卵移植到同品系假孕受體雌兔的輸卵管中,獲得新生轉(zhuǎn)基因仔兔,篩選子一代中轉(zhuǎn)基因雄兔作為精子供體兔,用于繁殖。新生轉(zhuǎn)基因家兔滿4個月后全日對其提供0.3%膽固醇添加飼料,持續(xù)16周,后將其大動脈及心臟全部分離摘出后用10%中性福爾馬林固定,采用HE染色觀察大動脈和冠狀動脈病理學(xué)變化及分子與蛋白水平變化。體外實驗采用帶有MMP9基因的慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,建立MMP9過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。實驗分組設(shè)置對照組、實驗組。根據(jù)細(xì)胞中MMP9基因的熒光表達(dá)情況,選擇最適轉(zhuǎn)染病毒濃度。RT-PCR,Western Blot進(jìn)一步驗證MMP9 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。嘌呤霉素5μg/μL濃度篩選2周,保種成功傳代的細(xì)胞。造模成功后,檢測過表達(dá)MMP9的HepG2細(xì)胞中PCSK9、LDLR在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果:通過比較高膽固醇負(fù)荷飲食喂養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因家兔與非轉(zhuǎn)基因家兔,血中低密度脂蛋白,甘油三酯和高密度脂蛋白無顯著差異,同時主動脈處動脈硬化斑塊面積及位置也無明顯差異,進(jìn)一步病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因組家兔內(nèi)膜病變處出現(xiàn)大量鈣鹽沉積,并伴隨不穩(wěn)定斑塊形成。免疫組化染色病理分析動脈病變內(nèi)部觀察到,與非轉(zhuǎn)基因家兔相比,轉(zhuǎn)基因家兔內(nèi)膜聚集更多富集脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞。對冠狀動脈分析結(jié)果顯示,相比較非轉(zhuǎn)基因家兔,轉(zhuǎn)基因家兔冠狀動脈斑塊表現(xiàn)出與主動脈類似的結(jié)果,富集更多巨噬細(xì)胞以及出現(xiàn)鈣鹽沉積。同時發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因家兔主動脈弓部MMP-2,MMP-12以及TIMP-1和TIMP-2蛋白表達(dá)增多。體外實驗結(jié)果顯示,帶有MMP9基因的慢病毒包裝質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,建立了 MMP9過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。MMP9基因過表達(dá)后,PCSK9在蛋白水平和mRNA水平均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。而LDLR在mRNA水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,LDLR蛋白水平未出現(xiàn)顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:動脈粥樣硬化的發(fā)生與MMP9過表達(dá)密切相關(guān)。一方面,巨噬細(xì)胞源性的MMP9增多促進(jìn)了動脈粥樣硬化進(jìn)展期病變的形成,同時促進(jìn)了血管鈣化的發(fā)生;另一方面,細(xì)胞過表達(dá)MMP9基因,下調(diào)了 PCSK9基因水平進(jìn)而影響LDLR表達(dá)水平,并可能影響脂質(zhì)代謝進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5
【圖文】：

圖－２邐１６周兔子體重變化趨勢圖逡逑３．３血漿脂質(zhì)水平監(jiān)測逡逑轉(zhuǎn)基因家兔滿４個月后全日對其提供０．３％膽固醇添加飼料，持續(xù)１６周，用同胎的轉(zhuǎn)基因家兔作為對照組。此期間采用血漿脂質(zhì)分析試劑盒，每周對血漿脂質(zhì)的變化進(jìn)行定：總膽固醇（ＴＣ邋），甘油三酯（ＴＧ邋），高密度脂蛋白膽固醇（ＨＤＬ－Ｃ邋）。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因家兔和非轉(zhuǎn)基因家兔在高膽固醇血癥方面沒有顯著差異（圖３）。說明了邋ＭＭＰ９轉(zhuǎn)基家兔和非轉(zhuǎn)基因家兔在高膽固醇飲食喂養(yǎng)１６周后，血漿脂質(zhì)水平變化無顯著差異。逡逑雄性逡逑２４００邐ＴＣ｛ｍｇ／ｄＬ）邐ｉｓｏｏ邐ＴＣ邋（ｍｇ／ｄＬ）逡逑＾邋ｊ邐／逡逑…

進(jìn)行病理學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)：早期的動脈粥樣硬化病變主要集中在主動脈弓部，Ｉｍａｇｅ邋Ｊ軟件逡逑計算病變面積得出：轉(zhuǎn)基因家兔和非轉(zhuǎn)基因家兔總體的病變面積在統(tǒng)計學(xué)上沒有明顯差異逡逑（圖４），結(jié)果表明了邋ＭＭＰ９表達(dá)在動脈硬化斑塊形成早期可能影響較小。逡逑雌性逡逑—４邋［□轉(zhuǎn)基因…邐ＪＬ逡逑｜３邋－邐［□栜基因網(wǎng)邋＾逡逑ＢＢＩｈ邐Ｉ２邋■邋ｒｎ邋Ｉ逡逑＿

本文編號：2803316