【摘要】：研究背景與目的:THO復(fù)合物包括THOC1、THOC2、THOC3、THOC5、THOC6、THOC7,與構(gòu)成TREX復(fù)合體的其他蛋白相互作用,參與mRNA轉(zhuǎn)錄和輸出,在轉(zhuǎn)錄延伸、核RNA輸出和基因組穩(wěn)定中起著重要的調(diào)控作用。THOC5通過(guò)與CPSF100形成復(fù)合體,錨定到THOC5的靶基因上參與RNA 3'末端加工,從而促進(jìn)立早基因(IEGs)包括Id1,d3和Wnt11(參與調(diào)控細(xì)胞分化和增殖)等表達(dá),影響細(xì)胞的增殖與分化。研究證實(shí),小鼠成纖維細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞THOC5的缺失分別引起143、99個(gè)基因下調(diào),這些基因大多是與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。在ESC細(xì)胞中,THOC5、THOC2缺失導(dǎo)致541個(gè)基因下調(diào),提示THOC5的表達(dá)水平和原始細(xì)胞狀態(tài)以及細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)。VSMC不同于心肌和骨骼肌,在受到刺激時(shí)可以發(fā)生表型轉(zhuǎn)換,去分化為合成表型,合成并分泌細(xì)胞因子和基質(zhì),增殖、遷移至內(nèi)膜引起病理改變,促進(jìn)血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。當(dāng)前對(duì)表型轉(zhuǎn)換的機(jī)制研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平和PI3K/ERK等信號(hào)通路上。最新的研究已經(jīng)開(kāi)始揭示轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在表型轉(zhuǎn)換中有著重要作用。了解與闡明血管疾病發(fā)展過(guò)程中動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換過(guò)程中THO復(fù)合體的作用尤為重要,THO復(fù)合物可以作為一個(gè)靶基因的識(shí)別工具。本研究旨在探討研究THO復(fù)合物特異性調(diào)控平滑肌標(biāo)志性基因表達(dá)的作用機(jī)制,期望為血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的研究通路和新的治療方向。研究方法:免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CEA斑塊中THO亞基THOC5、THOC2表達(dá),進(jìn)一步通過(guò)定量RT-PCR和Western blot驗(yàn)證Thoc5、Thoc2表達(dá)。定量RT-PCR檢測(cè)去分化血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中Thoc5、Thoc2表達(dá);構(gòu)建shRNA敲低Thoc5、Thoc2表達(dá),檢測(cè)平滑肌標(biāo)志性基因和增殖遷移能力的變化;RNA-seq分析Thoc5敲低后差異基因表達(dá);采用ChIP-seq、放線菌素(Act-D)實(shí)驗(yàn)、RIP-seq進(jìn)行機(jī)制研究;體內(nèi)球囊拉傷模型損傷頸動(dòng)脈局部和體外血管外膜成纖維細(xì)胞中高表達(dá)THOC5,采用定量RT-PCR、IHC、IF檢測(cè)平滑肌標(biāo)志性基因的變化。研究結(jié)果:免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CEA斑塊中THO亞基THOC5、THOC2表達(dá)水平顯著降低,定量RT-PCR和Western blot水平得到進(jìn)一步驗(yàn)證。定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)去分化VSMC中Thoc5、Thoc2 mRNA表達(dá)水平也顯著降低;構(gòu)建shRNA敲低Thoc5、Thoc2表達(dá),VSMC標(biāo)志性基因mRNA表達(dá)水平顯著降低,增殖和遷移能力顯著增加,表明THO亞基表達(dá)水平降低促使VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)換;RNA-seq從全基因角度分析顯示Thoc5可特異性調(diào)控VSMC標(biāo)志性基因,shThoc5組差異基因表達(dá)和PDGF-BB/DD刺激平滑肌后的差異基因表達(dá)具有高度相關(guān)性;ChIP-seq分析顯示THOC5結(jié)合的全基因組DNA只有14個(gè)微弱的峰;Act-D實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低Thoc5使得平滑肌標(biāo)志性基因穩(wěn)定性下降,半衰期縮短;RIP-seq分析發(fā)現(xiàn)THOC5和THOC2優(yōu)先結(jié)合平滑肌標(biāo)志性基因,對(duì)表型轉(zhuǎn)換過(guò)程中丟失結(jié)合基因mRNA進(jìn)行GSEA富集分析,結(jié)果顯示其顯著富集在P1代特異性高表達(dá)的基因側(cè);大鼠球囊拉傷模型中損傷頸動(dòng)脈局部高表達(dá)THOC5可以促使平滑肌標(biāo)志性基因表達(dá)水平顯著上升,抑制新生內(nèi)膜增生;血管外膜成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)THOC5也可以使平滑肌標(biāo)志性基因表達(dá)水平顯著升高,促使血管外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞。結(jié)論:本研究揭示了THO復(fù)合物對(duì)平滑肌標(biāo)志性基因的特異性調(diào)控作用,與VSMC標(biāo)志性基因mRNA的動(dòng)態(tài)結(jié)合可以作為VSMC表型轉(zhuǎn)換的新型機(jī)制,第一次提出THO復(fù)合物對(duì)平滑肌表型轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,其對(duì)平滑肌表型的正向調(diào)控作用,提示THOC5可以作為血管疾病的潛在干預(yù)節(jié)點(diǎn),為血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的研究通路和新的治療方向。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

終點(diǎn)事件：在隨訪期間，冠脈三支病變患者中有１３１２例死亡，其中６６３例患逡逑者為心血管死亡。逡逑圖１所示的ＫＭ曲線顯示冠脈三支病變患者不同ＢＭＩ組別的全因死亡風(fēng)險(xiǎn)差逡逑異顯著。與體重正�；颊呦啾�，超重患者的全因死亡風(fēng)險(xiǎn)較低（ＨＲ邋０．８３；邋９５％邋ＣＩ逡逑０．７３－０．９４），輕度肥胖患者全因死亡風(fēng)險(xiǎn)最低（ＨＲ邋０＿７６；邋９５％邋ＣＩ０＿６４－０．９１），體重過(guò)逡逑輕患者全因死亡風(fēng)險(xiǎn)最高（ＨＲ邋１．４４；邋９５％邋ＣＩ邋０．８９－１．３１邋）。逡逑將ＢＭＩ作為連續(xù)變量（圖２）用多項(xiàng)式回歸模型分析，表明ＢＭＩ與全因死亡逡逑風(fēng)險(xiǎn)之間呈現(xiàn)Ｕ型趨勢(shì)。逡逑0邐Ｉ－逡逑ｓ．逡逑ｏ逡逑ｓ．逡逑｜邐ｆ邐￣￣邐ｒ￣逡逑０邐５０邐１ＤＧ邐１５０逡逑邐枿訪時(shí)間（月）邐逡逑邐邐ｉａ邋５＜ＢＭＩ＜２４邋邐邋２４＜ＢＭＫ２ｅ逡逑邐２８＜ＢＭｉ＾３２邐邐邋ＢＭＫ１８．５逡逑—■邋ＢＭｌ＞３２邐逡逑圖１邋ＢＭＩ五組全因死亡的ＫＭ曲線逡逑１０逡逑

０．７３－０．９４），輕度肥胖患者全因死亡風(fēng)險(xiǎn)最低（ＨＲ邋０＿７６；邋９５％邋ＣＩ０＿６４－０．９１），體重過(guò)逡逑輕患者全因死亡風(fēng)險(xiǎn)最高（ＨＲ邋１．４４；邋９５％邋ＣＩ邋０．８９－１．３１邋）。逡逑將ＢＭＩ作為連續(xù)變量（圖２）用多項(xiàng)式回歸模型分析，表明ＢＭＩ與全因死亡逡逑風(fēng)險(xiǎn)之間呈現(xiàn)Ｕ型趨勢(shì)。逡逑0邐Ｉ－逡逑ｓ．逡逑ｏ逡逑ｓ．逡逑｜邐ｆ邐￣￣邐ｒ￣逡逑０邐５０邐１ＤＧ邐１５０逡逑邐枿訪時(shí)間（月）邐逡逑邐邐ｉａ邋５＜ＢＭＩ＜２４邋邐邋２４＜ＢＭＫ２ｅ逡逑邐２８＜ＢＭｉ＾３２邐邐邋ＢＭＫ１８．５逡逑—■邋ＢＭｌ＞３２邐逡逑圖１邋ＢＭＩ五組全因死亡的ＫＭ曲線逡逑１０逡逑

圖２邋ＢＭＩ作為連續(xù)變量多項(xiàng)式回歸模型逡逑ＰＣＩ亞組逡逑圖３用ＫＭ曲線顯示不同ＢＭＩ水平的生存情況，可以看到五組ＢＭＩ之間并無(wú)逡逑顯著差異。逡逑在調(diào)整了年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙史、飲酒史、冠心病家族史、陳逡逑舊心梗史、Ｓｙｎｔａｘ評(píng)分、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＴＧ后，做了不同ＢＭＩ組別全因死亡的逡逑ＣＯＸ回歸分析。結(jié)果顯示相對(duì)于體重正常患者，超重和輕度肥胖患者的全因死亡風(fēng)逡逑險(xiǎn)有降低的趨勢(shì)（ＨＲ邋０．９０；邋９５％邋ＣＩ邋０．７１－１．１２）、（ＨＲ邋０．９０；邋９５％邋ＣＩ邋０．６６－１．２３），重度逡逑肥胖患者的全因死亡風(fēng)險(xiǎn)有增加的趨勢(shì)（ＨＲ邋１．４５；邋９５％邋ＣＩ邋０．８７－２．４４），但均無(wú)統(tǒng)計(jì)逡逑學(xué)意義，體重較輕患者的全因死亡風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著差異（ＨＲ邋０．５９；邋９５％邋ＣＩ邋０．１４－２．３８）（圖逡逑４）。逡逑在調(diào)整了年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙史、飲酒史、冠心病家族史、陳逡逑舊心梗史、Ｓｙｎｔａｘ評(píng)分、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＴＧ后，做了不同ＢＭＩ組別心血管死亡逡逑的ＣＯＸ回歸分析，結(jié)果顯示相對(duì)于體重正�；颊撸鼗颊叩男难芩劳鲲L(fēng)險(xiǎn)有逡逑降低的趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ＨＲ邋０．８９；邋９５％邋ＣＩ邋０．６３－１．２４）

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本文編號(hào)：2803209