【摘要】：背景與目的:先天性長QT綜合征(congenital long QT syndrome,cLQTs)是研究室性心律失常及心源性猝死重要的疾病研究模型。HERG基因突變導(dǎo)致2型長QT綜合征,是致青少年猝死的重要原因。HERG-A561 V突變導(dǎo)致2型長QT綜合征的主要原因是蛋白轉(zhuǎn)運障礙,突變蛋白無法進行正確折疊,從而被滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),最終導(dǎo)致細胞膜上成熟且功能完備的HERG通道數(shù)量減少。研究表明蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)及蛋白質(zhì)糖基化在突變蛋白的折疊過程中發(fā)揮重要作用,但其具體機制尚未完全明確。本課題旨在研究葡萄糖苷酶Ⅱβ(GlucosidaseⅡβ)和糖蛋白葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶1(UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase 1,UGGT1)是否在HERG-A561V突變蛋白的轉(zhuǎn)運異常過程中起作用,及改變葡萄糖苷酶Ⅱβ的表達是否可以恢復(fù)突變蛋白轉(zhuǎn)運及在一定程度上改善HERG通道的功能,從而為LQTS及SCD尋求新的治療思路。方法:在HEK293細胞瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3-HERG、pcDNA3-HERG/pcDNA3-HERG-A561V、pcDNA3-HERG-A561V以分別構(gòu)建野生、雜合和突變組細胞。免疫印跡、免疫共沉淀和免疫熒光分別檢測各組間GlucosidaseⅡβ和UGGT1表達、與HERG蛋白結(jié)合及定位的情況;免疫印跡檢測調(diào)節(jié)葡萄糖苷酶Ⅱβ表達前后HERG蛋白表達的變化情況;全細胞膜片鉗技術(shù)檢測在上調(diào)葡萄糖苷酶Ⅱβ表達后HERG基因編碼的Ikr電流的變化情況。結(jié)果:WB檢測發(fā)現(xiàn)UGGT1和Glucosidase Ⅱβ在雜合、突變組細胞中的表達較之野生組增加。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞中HERG與UGGT1、GlucosidaseⅡβ之間的作用發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)UGGT1和GlucosidaseⅡβ在雜合、突變組細胞中與未成熟蛋白的結(jié)合比野生組增強。WB結(jié)果表明上調(diào)葡萄糖苷酶Ⅱβ的表達有利于促進雜合組細胞HERG-A561V蛋白的成熟,而下調(diào)的葡萄糖苷酶Ⅱβ則會抑制HERG-A561V蛋白的成熟和轉(zhuǎn)運。全細胞膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)在雜合組細胞中,電流密度在上調(diào)葡萄糖苷酶Ⅱβ的表達后增大,激活電流及尾電流的電流幅度分別增加55%和81%結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)糖基化及其相關(guān)酶類GlucosidaseⅡβ/UGGT1對HERG-A561V突變所致的蛋白轉(zhuǎn)運及成熟障礙有重要的調(diào)節(jié)作用,該作用在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生,且是由GlucosidaseⅡβ/UGGT1直接與未成熟的HERG蛋白相結(jié)合產(chǎn)生,而且上調(diào)GlucosidaseⅡβ可以在一定程度上恢復(fù)HERG通道蛋白的轉(zhuǎn)運和功能,這為臨床上治療LQTS及其他蛋白轉(zhuǎn)運障礙所致疾病提供了新的可能性。
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R541.7

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本文編號：2803580