【摘要】：研究背景及意義糖尿病屬于一類代謝異常疾病,可以由不同原因引起,臨床表現(xiàn)為慢性高血糖。隨著生活水平不斷提高、老齡化不斷加重、診斷方法不斷進步,糖尿病的發(fā)病率越來越高,已經(jīng)發(fā)展成為第三大非傳染病,位于心血管及惡性腫瘤后。糖尿病晚期階段,易合并一些別的器官組織損傷且不易治愈。經(jīng)常發(fā)生的糖尿病并發(fā)癥包括糖尿病足、糖尿病性心臟病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、呼吸道感染、泌尿道感染等。糖尿病對心臟的損害表現(xiàn)為多個方面,其中對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病而言,糖尿病是冠狀動脈疾病的一個主要的獨立危險因子。與非糖尿病患者相比,糖尿病患者冠心病發(fā)病時間更早,尤其是在腎病并存時;不典型心絞痛更常見;心肌梗死的死亡率更高。而糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病心臟并發(fā)癥的一種,屬于特異性疾病,患者多有5年以上糖尿病病史,且診斷過程中已經(jīng)排除高血壓病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等其他疾病引起的心肌損傷。糖尿病心肌病的一般病理特征涉及細胞及細胞間質(zhì),心肌細胞方面常見肥大、壞死、凋亡、心肌纖維的減少,細胞間質(zhì)方面的改變常見心肌間質(zhì)的彌漫性纖維化,微小血管可以出現(xiàn)基底膜增厚、微動脈瘤、基質(zhì)增加等改變;電鏡檢查可以發(fā)現(xiàn)心肌細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)等受到明顯損害,其中線粒體的改變很明顯,包括核周圍線粒體增多,線粒體腫脹等,另外線粒體周圍糖原和脂滴較正常時明顯聚集。而血糖升高可引起的包括自主神經(jīng)的病變、微循環(huán)功能的障礙、代謝或能量改變,以及晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)聚集增加等一系列的生理或代謝異常,與上述病理改變一起均參與了糖尿病心肌病的發(fā)生。在起始階段并沒有癥狀發(fā)生,隨著疾病發(fā)展,逐漸出現(xiàn)心力衰竭,首先表現(xiàn)為舒張性心力衰竭,其射血分數(shù)正常,然后出現(xiàn)收縮性心力衰竭,其射血分數(shù)降低。糖尿病合并心臟病已成為當代醫(yī)學(xué)危險最高的疾病組合之一,同時糖尿病心肌病的發(fā)病率和死亡率不斷急速升高,需進一步針對DCM進行研究,目前研究多關(guān)注于在心肌代謝異常、受體信號通路改變等病生異常,心肌代謝異常包括了氧化應(yīng)激反應(yīng)(Oxidative Stress,OS)增加、終末化糖基產(chǎn)物(AGEs)形成增多等。由高糖毒性產(chǎn)物介導(dǎo)的多種細胞信號通路包括了炎癥信號通路、蛋白激酶C(PKC)通路、及絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路等。除此之外,細胞凋亡對心臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。細胞凋亡是一種細胞的程序性死亡,在各種內(nèi)外因素作用下,細胞內(nèi)特定程序被啟動,經(jīng)過多途徑的信號傳導(dǎo),最后激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶,導(dǎo)致了細胞自然死亡。目前找到的與細胞凋亡機制相關(guān)的包括細胞色素C(Cytc)、P53、Bcl-2、Caspase-3等,其中Bd-2為抑制凋亡成分,Caspase-3為促進凋亡成分。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼單鏈RNA,長度為22-23個堿基,它通過結(jié)合于靶mRNA的3'-UTR,影響mRNA翻譯或者直接講解。很多研究發(fā)現(xiàn),在機體的很多種生命活動中,均有miRNA的參與,包括細胞增殖、分化、凋亡、組織發(fā)育等。另有研究發(fā)現(xiàn),心肌細胞中的miRNAs表達上調(diào)可能參與了心室重構(gòu)、心肌肥厚、離子通道表達、自噬等一些病理生理過程。進一步有學(xué)者指出,micro RNA出現(xiàn)在胰島素抵抗時心臟病變過程中。從以上得出,microRNA可能在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要作用。有研究表明,miR-30c通過調(diào)控Beclin蛋白表達參與糖尿病心肌病過程。miR-30b是miR-30族的的一員,位于人第8號染色體,在腫瘤發(fā)生、線粒體分裂和細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,但是miR-30b在糖尿病心肌病中作用,至今未見相關(guān)報道。這給我們提示,miR-30b在DCM心肌細胞中表達如何?如果表達異常,它是否參與了糖尿病心肌病的致病過程?本研究通過結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實驗探索了 miR-30b在糖尿病心肌病中的作用和潛在的分子機制,為其在糖尿病心肌病中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ),同時為糖尿病心肌病治療發(fā)掘新的藥物靶點。本研究共分為四個部分,第一部分,通過造模制備大鼠糖尿病心肌病模型和對照組,采用微小RNA芯片高通量篩選差異表達miRNAs,并采用qRT-PCR驗證;第二部分,用高濃度糖培養(yǎng)H9C2心肌細胞,然后測定高濃度糖對心肌細胞凋亡率、促細胞凋亡因子和細胞凋亡抑制因子表達水平、miRNA-30b的mRNA水平的影響;第三部分,采用轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾心肌細胞中miRNA-30b的表達,觀察干擾miRNA-30b表達對心肌細胞凋亡、細胞凋亡因子和細胞凋亡抑制因子表達水平的影響;第四部分,采用微小RNA數(shù)據(jù)庫Target Scan預(yù)測miRNA-30b潛在靶基因,觀察miRNA-30b mimic轉(zhuǎn)染對靶基因mRNA水平和蛋白表達的影響,進一步用熒光素酶報告基因技術(shù)驗證miRNA-30b的靶基因。第一部分糖尿病心肌病大鼠心肌組織中微小RNA的聚類分析研究目的:1.探索糖尿病心肌病大鼠模型的基本情況及形態(tài)變化;2.探索糖尿病心肌病大鼠中差異表達的miRNAs并驗證。研究方法:1.將實驗大鼠分為糖尿病心肌病組、對照組,通過超聲心動圖、蘇木精-伊紅染色法測定糖尿病心肌病大鼠模型是否構(gòu)建成功;2.分析DCM組與對照組大鼠心肌組織中miRNA表達譜,篩選出差異表達的miRNAs;3.使用qRT-PCR測定miR-30b在DCM組和對照組大鼠心肌組織中的表達水平。研究結(jié)果:1.DCM 組的 A 值、EDT(Edeceleration time)、EDT'、IVRT(Isovlumic relaxation time)和IVRT'顯著高于對照組,E值、EF(Ejectionfraction)、E/A低于對照組,HE染色中,與對照組相比,DCM組大鼠心肌細胞排列疏松紊亂,細胞核大小不一,有少量壞死灶充斥在間質(zhì)結(jié)構(gòu)中;2.在DCM組大鼠心肌組織中182個miRNAs與對照組大鼠心肌組織相比存在差異表達,其中上調(diào)最顯著的miRNA為miR-30b;3.miR-30b在DCM組大鼠心肌組織中的表達與對照組大鼠心肌組織相比顯著上調(diào)。結(jié)論:miR-30b表達在DCM大鼠中上調(diào),提示miR-30b參與了 DCM的發(fā)生發(fā)展過程。第二部分高濃度糖誘導(dǎo)心肌細胞上調(diào)miRNA-30b及細胞凋亡研究目的:1.探究高糖對大鼠心肌細胞凋亡的影響及機制;2.探究高糖對miRNA-30b表達的影響。研究方法:1.將實驗心肌細胞分為正常組、高糖組,并采用流式細胞儀分析各組心肌細胞凋亡情況;2.采用蛋白印跡法測定各組心肌細胞中細胞凋亡相關(guān)因子半胱天冬酶-3(Caspase-3)和DNA修復(fù)酶PARP以及細胞凋亡抑制因子B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)的蛋白表達;3.采用qRT-PCR檢測技術(shù)測定正常組和高糖組大鼠心肌細胞H9c2中miRNA-30b的表達情況。研究結(jié)果:1.高糖組中,大鼠心肌細胞的早期細胞凋亡率隨著高糖處理的時間增加而顯著增加,對照組沒有顯著差異;2.隨著高糖處理時間的增加,高糖組細胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3和PARP的蛋白表達明顯增加,而細胞凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表達明顯減少,對照組沒有顯著差異;3.高糖組中,miRNA-30b的mRNA表達隨著高糖處理的時間增加而顯著增加,對照組無顯著差異。結(jié)論:高糖能夠通過增加細胞凋亡因子水平、降低細胞凋亡抑制因子水平促進心肌細胞凋亡,并能夠增加miRNA-30b的表達水平。第三部分抑制miRNA-30b的表達降低大鼠心肌細胞的凋亡研究目的:探索miRNA-30b表達對大鼠心肌細胞凋亡的影響。研究方法:1.將實驗大鼠心肌細胞通過培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染實驗,分為正常組、高糖組、高糖+miRNA-30b抑制組和高糖+陰性對照組,并測定每組心肌細胞的凋亡率;2.采用蛋白印跡法測定各組細胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3和PARP,以及細胞凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表達;研究結(jié)果:1.高糖組心肌細胞凋亡率顯著高于正常組,高糖+miRNA-30b抑制組心肌細胞凋亡率明顯低于高糖+陰性對照組;2.高糖組Caspase-3和PARP的表達水平顯著高于正常組,而高糖+miRNA-30b抑制組的表達顯著低于高糖+陰性對照組;高糖組Bcl-2的表達水平顯著低于正常組,而高糖+miRNA-30b抑制組的Bcl-2表達顯著高于高糖+陰性對照組。結(jié)論:高糖處理能夠通過提高細胞凋亡因子表達水平、降低細胞凋亡抑制因子表達促進心肌細胞凋亡,而通過轉(zhuǎn)染miRNA-30b抑制劑降低miRNA-30b表達后,能顯著降低心肌細胞的凋亡率。第四部分miRNA-30b負性調(diào)控Bcl-2的表達研究目的:探究Bcl-2是否為miRNA-30b的靶基因。研究方法:1.利用生物信息學(xué)預(yù)測miRNA-30的潛在靶基因;2.采用qRT-PCR、蛋白印跡法測定轉(zhuǎn)染miRNA-30b mimic對靶基因mRNA水平和蛋白表達的影響;3.進一步用熒光素酶報告基因技術(shù)驗證miRNA-30b和靶基因之間的關(guān)系。研究結(jié)果:1.Target Scan(http://www.targetscan.org/)預(yù)測凋亡抑制因子 Bcl-2 是 miR-30b的潛在靶基因;2.轉(zhuǎn)染miRNA-30b mimic能夠降低Bcl-2 3'UTR wt的熒光素酶活性;3.轉(zhuǎn)染miRNA-30b mimic能夠降低Bcl-2的mRNA及蛋白表達水平。結(jié)論:Bcl-2為miRNA-30b的靶基因,miRNA-30b能夠通過負向調(diào)控Bcl-2的表達發(fā)揮其在DCM中的作用。綜合結(jié)論:糖尿病心肌病時,miRNA-30b表達水平上調(diào),并可通過對靶基因Bcl-2的負性調(diào)控作用促進心肌細胞凋亡,參與了 DCM的發(fā)生發(fā)展過程。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R542.2
【圖文】：

圖２對照組，ＤＣＭ組的大鼠心肌組織中總ＲＮＡ的電泳圖，Ｉ泳道為對照逡逑

圖３邋ＤＣＭ組與對照組大鼠心肌組織中ｍｉＲＮＡｓ表達譜的聚類分析逡逑與對照組相比，ＤＣＭ組大鼠心肌組織中上調(diào)最顯著的ｍｉＲＮＡ為ｍＲ－３０ｂ，其上調(diào)逡逑倍數(shù)變化值為２．５。逡逑５５逡逑

圖４邋ｍｉＲ－３０ｂ在ＤＣＭ組和對照組大鼠心肌組織中的表達驗證逡逑ｍｉＲ－３０ｂ在ＤＣＭ組大鼠心肌組織中的表達與對照組大鼠心肌組織相比顯著逡逑上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜0．０１）。逡逑

本文編號：2801541