【摘要】：研究背景及意義糖尿病屬于一類代謝異常疾病,可以由不同原因引起,臨床表現(xiàn)為慢性高血糖。隨著生活水平不斷提高、老齡化不斷加重、診斷方法不斷進(jìn)步,糖尿病的發(fā)病率越來越高,已經(jīng)發(fā)展成為第三大非傳染病,位于心血管及惡性腫瘤后。糖尿病晚期階段,易合并一些別的器官組織損傷且不易治愈。經(jīng)常發(fā)生的糖尿病并發(fā)癥包括糖尿病足、糖尿病性心臟病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、呼吸道感染、泌尿道感染等。糖尿病對(duì)心臟的損害表現(xiàn)為多個(gè)方面,其中對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病而言,糖尿病是冠狀動(dòng)脈疾病的一個(gè)主要的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。與非糖尿病患者相比,糖尿病患者冠心病發(fā)病時(shí)間更早,尤其是在腎病并存時(shí);不典型心絞痛更常見;心肌梗死的死亡率更高。而糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病心臟并發(fā)癥的一種,屬于特異性疾病,患者多有5年以上糖尿病病史,且診斷過程中已經(jīng)排除高血壓病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等其他疾病引起的心肌損傷。糖尿病心肌病的一般病理特征涉及細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì),心肌細(xì)胞方面常見肥大、壞死、凋亡、心肌纖維的減少,細(xì)胞間質(zhì)方面的改變常見心肌間質(zhì)的彌漫性纖維化,微小血管可以出現(xiàn)基底膜增厚、微動(dòng)脈瘤、基質(zhì)增加等改變;電鏡檢查可以發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)等受到明顯損害,其中線粒體的改變很明顯,包括核周圍線粒體增多,線粒體腫脹等,另外線粒體周圍糖原和脂滴較正常時(shí)明顯聚集。而血糖升高可引起的包括自主神經(jīng)的病變、微循環(huán)功能的障礙、代謝或能量改變,以及晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)聚集增加等一系列的生理或代謝異常,與上述病理改變一起均參與了糖尿病心肌病的發(fā)生。在起始階段并沒有癥狀發(fā)生,隨著疾病發(fā)展,逐漸出現(xiàn)心力衰竭,首先表現(xiàn)為舒張性心力衰竭,其射血分?jǐn)?shù)正常,然后出現(xiàn)收縮性心力衰竭,其射血分?jǐn)?shù)降低。糖尿病合并心臟病已成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)危險(xiǎn)最高的疾病組合之一,同時(shí)糖尿病心肌病的發(fā)病率和死亡率不斷急速升高,需進(jìn)一步針對(duì)DCM進(jìn)行研究,目前研究多關(guān)注于在心肌代謝異常、受體信號(hào)通路改變等病生異常,心肌代謝異常包括了氧化應(yīng)激反應(yīng)(Oxidative Stress,OS)增加、終末化糖基產(chǎn)物(AGEs)形成增多等。由高糖毒性產(chǎn)物介導(dǎo)的多種細(xì)胞信號(hào)通路包括了炎癥信號(hào)通路、蛋白激酶C(PKC)通路、及絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路等。除此之外,細(xì)胞凋亡對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞的程序性死亡,在各種內(nèi)外因素作用下,細(xì)胞內(nèi)特定程序被啟動(dòng),經(jīng)過多途徑的信號(hào)傳導(dǎo),最后激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶,導(dǎo)致了細(xì)胞自然死亡。目前找到的與細(xì)胞凋亡機(jī)制相關(guān)的包括細(xì)胞色素C(Cytc)、P53、Bcl-2、Caspase-3等,其中Bd-2為抑制凋亡成分,Caspase-3為促進(jìn)凋亡成分。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼單鏈RNA,長(zhǎng)度為22-23個(gè)堿基,它通過結(jié)合于靶mRNA的3'-UTR,影響mRNA翻譯或者直接講解。很多研究發(fā)現(xiàn),在機(jī)體的很多種生命活動(dòng)中,均有miRNA的參與,包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、組織發(fā)育等。另有研究發(fā)現(xiàn),心肌細(xì)胞中的miRNAs表達(dá)上調(diào)可能參與了心室重構(gòu)、心肌肥厚、離子通道表達(dá)、自噬等一些病理生理過程。進(jìn)一步有學(xué)者指出,micro RNA出現(xiàn)在胰島素抵抗時(shí)心臟病變過程中。從以上得出,microRNA可能在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要作用。有研究表明,miR-30c通過調(diào)控Beclin蛋白表達(dá)參與糖尿病心肌病過程。miR-30b是miR-30族的的一員,位于人第8號(hào)染色體,在腫瘤發(fā)生、線粒體分裂和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,但是miR-30b在糖尿病心肌病中作用,至今未見相關(guān)報(bào)道。這給我們提示,miR-30b在DCM心肌細(xì)胞中表達(dá)如何?如果表達(dá)異常,它是否參與了糖尿病心肌病的致病過程?本研究通過結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探索了 miR-30b在糖尿病心肌病中的作用和潛在的分子機(jī)制,為其在糖尿病心肌病中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ),同時(shí)為糖尿病心肌病治療發(fā)掘新的藥物靶點(diǎn)。本研究共分為四個(gè)部分,第一部分,通過造模制備大鼠糖尿病心肌病模型和對(duì)照組,采用微小RNA芯片高通量篩選差異表達(dá)miRNAs,并采用qRT-PCR驗(yàn)證;第二部分,用高濃度糖培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞,然后測(cè)定高濃度糖對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率、促細(xì)胞凋亡因子和細(xì)胞凋亡抑制因子表達(dá)水平、miRNA-30b的mRNA水平的影響;第三部分,采用轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾心肌細(xì)胞中miRNA-30b的表達(dá),觀察干擾miRNA-30b表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞凋亡因子和細(xì)胞凋亡抑制因子表達(dá)水平的影響;第四部分,采用微小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)Target Scan預(yù)測(cè)miRNA-30b潛在靶基因,觀察miRNA-30b mimic轉(zhuǎn)染對(duì)靶基因mRNA水平和蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證miRNA-30b的靶基因。第一部分糖尿病心肌病大鼠心肌組織中微小RNA的聚類分析研究目的:1.探索糖尿病心肌病大鼠模型的基本情況及形態(tài)變化;2.探索糖尿病心肌病大鼠中差異表達(dá)的miRNAs并驗(yàn)證。研究方法:1.將實(shí)驗(yàn)大鼠分為糖尿病心肌病組、對(duì)照組,通過超聲心動(dòng)圖、蘇木精-伊紅染色法測(cè)定糖尿病心肌病大鼠模型是否構(gòu)建成功;2.分析DCM組與對(duì)照組大鼠心肌組織中miRNA表達(dá)譜,篩選出差異表達(dá)的miRNAs;3.使用qRT-PCR測(cè)定miR-30b在DCM組和對(duì)照組大鼠心肌組織中的表達(dá)水平。研究結(jié)果:1.DCM 組的 A 值、EDT(Edeceleration time)、EDT'、IVRT(Isovlumic relaxation time)和IVRT'顯著高于對(duì)照組,E值、EF(Ejectionfraction)、E/A低于對(duì)照組,HE染色中,與對(duì)照組相比,DCM組大鼠心肌細(xì)胞排列疏松紊亂,細(xì)胞核大小不一,有少量壞死灶充斥在間質(zhì)結(jié)構(gòu)中;2.在DCM組大鼠心肌組織中182個(gè)miRNAs與對(duì)照組大鼠心肌組織相比存在差異表達(dá),其中上調(diào)最顯著的miRNA為miR-30b;3.miR-30b在DCM組大鼠心肌組織中的表達(dá)與對(duì)照組大鼠心肌組織相比顯著上調(diào)。結(jié)論:miR-30b表達(dá)在DCM大鼠中上調(diào),提示miR-30b參與了 DCM的發(fā)生發(fā)展過程。第二部分高濃度糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞上調(diào)miRNA-30b及細(xì)胞凋亡研究目的:1.探究高糖對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制;2.探究高糖對(duì)miRNA-30b表達(dá)的影響。研究方法:1.將實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞分為正常組、高糖組,并采用流式細(xì)胞儀分析各組心肌細(xì)胞凋亡情況;2.采用蛋白印跡法測(cè)定各組心肌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)因子半胱天冬酶-3(Caspase-3)和DNA修復(fù)酶PARP以及細(xì)胞凋亡抑制因子B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)的蛋白表達(dá);3.采用qRT-PCR檢測(cè)技術(shù)測(cè)定正常組和高糖組大鼠心肌細(xì)胞H9c2中miRNA-30b的表達(dá)情況。研究結(jié)果:1.高糖組中,大鼠心肌細(xì)胞的早期細(xì)胞凋亡率隨著高糖處理的時(shí)間增加而顯著增加,對(duì)照組沒有顯著差異;2.隨著高糖處理時(shí)間的增加,高糖組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3和PARP的蛋白表達(dá)明顯增加,而細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯減少,對(duì)照組沒有顯著差異;3.高糖組中,miRNA-30b的mRNA表達(dá)隨著高糖處理的時(shí)間增加而顯著增加,對(duì)照組無顯著差異。結(jié)論:高糖能夠通過增加細(xì)胞凋亡因子水平、降低細(xì)胞凋亡抑制因子水平促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,并能夠增加miRNA-30b的表達(dá)水平。第三部分抑制miRNA-30b的表達(dá)降低大鼠心肌細(xì)胞的凋亡研究目的:探索miRNA-30b表達(dá)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。研究方法:1.將實(shí)驗(yàn)大鼠心肌細(xì)胞通過培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),分為正常組、高糖組、高糖+miRNA-30b抑制組和高糖+陰性對(duì)照組,并測(cè)定每組心肌細(xì)胞的凋亡率;2.采用蛋白印跡法測(cè)定各組細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3和PARP,以及細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表達(dá);研究結(jié)果:1.高糖組心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于正常組,高糖+miRNA-30b抑制組心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖+陰性對(duì)照組;2.高糖組Caspase-3和PARP的表達(dá)水平顯著高于正常組,而高糖+miRNA-30b抑制組的表達(dá)顯著低于高糖+陰性對(duì)照組;高糖組Bcl-2的表達(dá)水平顯著低于正常組,而高糖+miRNA-30b抑制組的Bcl-2表達(dá)顯著高于高糖+陰性對(duì)照組。結(jié)論:高糖處理能夠通過提高細(xì)胞凋亡因子表達(dá)水平、降低細(xì)胞凋亡抑制因子表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,而通過轉(zhuǎn)染miRNA-30b抑制劑降低miRNA-30b表達(dá)后,能顯著降低心肌細(xì)胞的凋亡率。第四部分miRNA-30b負(fù)性調(diào)控Bcl-2的表達(dá)研究目的:探究Bcl-2是否為miRNA-30b的靶基因。研究方法:1.利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA-30的潛在靶基因;2.采用qRT-PCR、蛋白印跡法測(cè)定轉(zhuǎn)染miRNA-30b mimic對(duì)靶基因mRNA水平和蛋白表達(dá)的影響;3.進(jìn)一步用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證miRNA-30b和靶基因之間的關(guān)系。研究結(jié)果:1.Target Scan(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)凋亡抑制因子 Bcl-2 是 miR-30b的潛在靶基因;2.轉(zhuǎn)染miRNA-30b mimic能夠降低Bcl-2 3'UTR wt的熒光素酶活性;3.轉(zhuǎn)染miRNA-30b mimic能夠降低Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)論:Bcl-2為miRNA-30b的靶基因,miRNA-30b能夠通過負(fù)向調(diào)控Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮其在DCM中的作用。綜合結(jié)論:糖尿病心肌病時(shí),miRNA-30b表達(dá)水平上調(diào),并可通過對(duì)靶基因Bcl-2的負(fù)性調(diào)控作用促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,參與了 DCM的發(fā)生發(fā)展過程。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2;R542.2
【圖文】：

圖２對(duì)照組，ＤＣＭ組的大鼠心肌組織中總ＲＮＡ的電泳圖，Ｉ泳道為對(duì)照逡逑

圖３邋ＤＣＭ組與對(duì)照組大鼠心肌組織中ｍｉＲＮＡｓ表達(dá)譜的聚類分析逡逑與對(duì)照組相比，ＤＣＭ組大鼠心肌組織中上調(diào)最顯著的ｍｉＲＮＡ為ｍＲ－３０ｂ，其上調(diào)逡逑倍數(shù)變化值為２．５。逡逑５５逡逑

圖４邋ｍｉＲ－３０ｂ在ＤＣＭ組和對(duì)照組大鼠心肌組織中的表達(dá)驗(yàn)證逡逑ｍｉＲ－３０ｂ在ＤＣＭ組大鼠心肌組織中的表達(dá)與對(duì)照組大鼠心肌組織相比顯著逡逑上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜0．０１）。逡逑

本文編號(hào)：2801541