發(fā)布時(shí)間：2020-08-22 17:14

【摘要】：第一部分Sac-1+心臟間充質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體的分離和鑒定目的:分離、純化Sca-1+心臟間充質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體,并進(jìn)行鑒定。方法:取野生型的C57BL/6小鼠的心臟,用兩步法獲得Sca-1+心臟間充質(zhì)細(xì)胞。先用磁珠分選去除含有造血細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞,再用Sca-1標(biāo)記的磁珠進(jìn)行二次分選獲得Sca-1+心臟間充質(zhì)細(xì)胞(CMCs)。通過流式細(xì)胞學(xué)分析CMCs的表面抗原如CD105、CD44、CD140和c-kit,同時(shí)應(yīng)用免疫熒光染色分析細(xì)胞GATA4和Ki67的表達(dá)。使用去除外泌體的含有10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)CMCs48小時(shí),收集培養(yǎng)液,經(jīng)沉淀法獲得外泌體。使用免疫電鏡和納米顆粒示蹤分析法對所得外泌體進(jìn)行鑒定,進(jìn)一步提取外泌體蛋白,通過Western blot檢測CD63、CD81和Tsg101等在外泌體蛋白中的表達(dá)。結(jié)果:經(jīng)上述方法獲得Sca-1+心臟間充質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞CD105+、CD44+、CD140+、和c-kit+的細(xì)胞比例分別為86%,91%、65%、和6.8%;免疫熒光染色證實(shí)大多數(shù)心臟間充質(zhì)細(xì)胞是GATA4+的,具有持續(xù)增殖更新能力。使用沉淀法可獲得來源于Sca-1+心臟間充質(zhì)細(xì)胞的外泌體(CMC-Exo),經(jīng)免疫電鏡分析和納米顆粒示蹤分析顯示所得的細(xì)胞外囊泡平均直徑約120nm,符.合外泌體的特點(diǎn)。Western blot實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)其含有外泌體特征性蛋白如CD63,CD81和Tsg101。結(jié)論:來源于Sca-1+CMCs的細(xì)胞外囊泡經(jīng)分離、純化,經(jīng)鑒定符合外泌體的特點(diǎn)。第二部分CMC-Exo對小鼠心肌梗死模型的保護(hù)作用目的:通過在體實(shí)驗(yàn)評估并證實(shí)CMC-Exo對小鼠心肌梗死模型的保護(hù)作用。方法:取15只2-3月C57BL/6雌性小鼠建立心肌梗死模型,結(jié)扎左前降支近段,在缺血的邊緣區(qū)經(jīng)心肌內(nèi)注射CMC-Exo(30 μl,50μg,n=8)或者等體積PBS(n=7)在術(shù)前、術(shù)后24h和術(shù)后一月行超聲心動圖檢查評估心功能。術(shù)后一月安樂死動物,心臟標(biāo)本被固定、脫水和制作冰凍切片。應(yīng)用Masson's trichrome染色分析心肌梗死的范圍和室壁厚度,組織免疫熒光染色檢測EdU、CD31、Ki67和TNI的表達(dá)和分布,使用Image J軟件計(jì)數(shù)單位面積心臟組織內(nèi)CD31+毛細(xì)血管數(shù),計(jì)算心梗邊緣區(qū)的血管密度結(jié)果:成功建立穩(wěn)定的心肌梗死模型。行超聲心動圖檢測和分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMC-Exo可明顯改善心肌梗死,后一月的左室射血分?jǐn)?shù);;心臟組織Masson's trichrome染色及免疫熒光染色結(jié)果顯示與PBS組相比,外泌體治療一個(gè)月后心肌梗死的范圍明顯減小,梗死區(qū)的室壁厚度顯著高于PBS組;心肌梗死邊緣區(qū)CD31染色陽性率明顯增加。在梗死區(qū)和邊緣區(qū)EdU+或Ki67+細(xì)胞顯著增加,免疫熒光染色顯示多為內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,同時(shí)發(fā)現(xiàn)外泌體治療組存在較多的處于增殖期的心肌細(xì)胞。結(jié)論:研究發(fā)現(xiàn)CMC-Exo可明顯改善心肌梗死后的左心功能,促進(jìn)梗死邊緣區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞和少量心肌細(xì)胞的增殖,增加血管密度,提示Sca-1+心臟間充質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體可促進(jìn)血管新生第三部分CMC-Exo對小鼠下肢缺血模型的保護(hù)作用目的:通過在體實(shí)驗(yàn)評估并證實(shí)CMC-Exo對小鼠下肢缺血模型的保護(hù)作用。方法:取12只2-3月C57BL/6雌性小鼠建立左側(cè)下肢缺血模型,左側(cè)股動脈及分支被結(jié)扎后,在下肢缺血肌肉內(nèi)注射CMC-Exo(30 μl,50 μg,n=7)或者等體積PBS(n=5)。在術(shù)前及術(shù)后1天,15天和28天行激光多普勒影像檢查,評估與對側(cè)相比下肢足掌的血流灌注。術(shù)后一月安樂死動物,肌肉標(biāo)本被固定、脫水和制作石蠟切片。應(yīng)用組織免疫熒光染色檢測lectin的表達(dá)和分布,使用Image J軟件計(jì)數(shù)單位面積的肌肉組織內(nèi)lectin+毛細(xì)血管數(shù),計(jì)算下肢肌肉的血管密度。結(jié)果:成功建立下肢缺血模型。行激光多普勒影像學(xué)檢查和分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMC-Exo可明顯促進(jìn)術(shù)后2周和4周的下肢血流灌注的恢復(fù);lectin免疫熒光染色結(jié)果顯示CMC-Exo治療組的下肢肌肉毛細(xì)血管密度高于PBS組(535.5 ±133.5/mm2 vs 479.0± 110.9/mm2),但兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:研究發(fā)現(xiàn)CMC-Exo可明顯改善下肢缺血后2周和4周血流灌注,但未顯著增加術(shù)后一月下肢肌肉的毛細(xì)血管密度。第四部分CMC-Exo對缺血性心血管模型保護(hù)作用的體外實(shí)驗(yàn)研究目的:通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索CMC-Exo發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制方法:應(yīng)用CMC-Exo或等體積PBS干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),于37℃、5%CO2孵育20小時(shí),通過成管實(shí)驗(yàn)觀察微管網(wǎng)絡(luò)的形成,并使用EVOS顯微鏡記錄影像。使用Image J軟件分析血管網(wǎng)絡(luò);予不同劑量CMC-Exo干預(yù)HUVECs24小時(shí),應(yīng)用Western blot檢測PCNA、Erk等蛋白的表達(dá);抽提CMCs和CMC-Exo的總RNA,應(yīng)用基因芯片miRNA4.0 Array分析相對于CMCs而言,CMC-Exo內(nèi)含miRNAs的構(gòu)成和含量;為驗(yàn)證CMC-Exo注射后是否會增加肌肉內(nèi)miRNA的水平,結(jié)扎小鼠左側(cè)股動脈后經(jīng)肌肉內(nèi)注射50 μg CMC-Exo,右側(cè)注射等體積PBS作為對照。術(shù)后24小時(shí)收集肌肉組織,提取總RNA,使用qPCR檢測相應(yīng)miRNA的表達(dá)。應(yīng)用TargetScan數(shù)據(jù)庫及Funrich軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:HUVECs介導(dǎo)的成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CMC-Exo顯著促進(jìn)微管網(wǎng)絡(luò)形成;不同劑量CMC-Exo干預(yù)HUVECs未見PCNA、Erk等蛋白表達(dá)增加;miRNA微陣分析結(jié)果顯示相對于CMCs,CMC-Exo內(nèi)富含最多的miRNA是miR-7116-5p;qPCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),肌肉內(nèi)注射CMC-Exo后,miR-7116-5p在肌肉內(nèi)的表達(dá)升高20倍,提示miR-7116-5p可以通過CMC-Exo轉(zhuǎn)運(yùn)至肌肉內(nèi);;基因信息學(xué)分析提示miR-7116-5p可能負(fù)性調(diào)節(jié)泛素化,或參與GTP結(jié)合或ATP結(jié)合蛋白的活動。結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMC-Exo具有顯著促進(jìn)HUVECs介導(dǎo)的微管網(wǎng)絡(luò)形成;相對于CMCs,CMC-Exo內(nèi)含量最豐富的miRNA是miR-7116-5p,后者可能通過抑制泛素化,或者參與ATP結(jié)合相關(guān)蛋白的調(diào)控過程發(fā)揮重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54

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本文編號：2800937