【摘要】：目的:血管增生(vascular hyperplasia)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄等心血管疾病中普遍存在的病理生理表現(xiàn)。其主要特征表現(xiàn)為血管損傷后,位于血管中膜呈收縮表型的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇?增殖并遷移至內(nèi)膜從而導(dǎo)致的一種血管重構(gòu)現(xiàn)象。血小板源生長因子(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)由血管損傷部位的血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、VSMC和炎性細(xì)胞分泌產(chǎn)生,與其受體(PDGF receptor-b,PDGFR-β)結(jié)合后能夠引起VSMC表型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而發(fā)揮促細(xì)胞增殖和遷移的作用,對于血管重塑和內(nèi)膜增生的發(fā)生發(fā)展具有明顯的促進(jìn)作用。內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞來源的neuropilin樣分子(endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like molecule,ESDN)是一類I型跨膜蛋白(type-I transmembrane protein),最初是在人類冠狀動(dòng)脈和高度轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞中克隆得到的,其分子內(nèi)含有一個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域和一個(gè)凝血因子V/VIII同源結(jié)構(gòu),與Neuropilins結(jié)構(gòu)相似。課題組之前的研究表明,在培養(yǎng)的VSMC中,處于增殖狀態(tài)時(shí)ESDN表達(dá)顯著高于生長抑制的細(xì)胞,而ESDN的過度表達(dá)會(huì)抑制VSMC生長。在PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖模型中,ESDN敲除及敲低能夠上調(diào)PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用。該結(jié)果表明ESDN在調(diào)節(jié)血管細(xì)胞生長方面起著重要作用,其分子機(jī)制可能與ESDN對PDGF-BB及其受體的調(diào)控有關(guān),但是,ESDN調(diào)控PDGF受體信號途徑影響VSMC增殖和血管增生的機(jī)制研究目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增生模型以及PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC增殖模型,探討ESDN調(diào)控PDGF受體信號途徑影響VSMC增殖及其與血管重構(gòu)的關(guān)系。方法:1.平滑肌細(xì)胞特異性敲除小鼠的培育和基因型鑒定:利用從耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管系Dr.Mehran Sadeghi(Yale University School of Medicine)實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)Esdn~(flox/flox)小鼠和購買的SM22a-Cre小鼠培育平滑肌細(xì)胞特異性敲除小鼠。選取6~8周齡大小的小鼠,按雌雄比例為2:1進(jìn)行交配,繁殖仔鼠,取仔鼠鼠耳組織提取基因組DNA,用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定,成功培育出Cre~(+/-)Esdn~(flox/flox)小鼠及其對照Cre~(-/-)Esdn~(flox/flox)小鼠,同時(shí)提取血管組織Western blot驗(yàn)證其敲除效果。2.小鼠內(nèi)膜增生模型制備與分組選取8~12周的WT、Esdn~(-/-)小鼠,平滑肌細(xì)胞特異性敲除小鼠,雄性,各30只,隨機(jī)分為3 d、7 d、14 d、21 d和假手術(shù)組,異氟烷吸入式麻醉,體式顯微鏡下行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù),假手術(shù)組只分離血管,不結(jié)扎,分別于結(jié)扎術(shù)后3、7、14、21 d時(shí)生理鹽水心臟灌流后取材。將取材的血管分為兩部分,一部分用OCT包埋劑包埋、液氮迅速冷凍、冰凍切片,備用;另一部分用RIPA裂解液(50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl,0.5%脫氧膽酸鈉,1%NP-40,0.1%SDS,1 mM EDTA),臨用前加入complete proteinase inhibitor(Roche Applied Sciences)和phosphatase inhibitor cocktails(Sigma-Aldrich)裂解,提取總蛋白質(zhì),Western blot檢測VSMC增殖標(biāo)志蛋白骨橋蛋白(osteopontin,OPN)以及分化標(biāo)志基因α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(smooth musclea-actin,SMa-actin)、平滑肌22a(smooth muscle22 alpha,SM22a)的表達(dá)。3.冰凍切片HE染色和免疫熒光染色分析選取結(jié)扎不同時(shí)間血管組織的冰凍切片(5mm),進(jìn)行組織HE染色及免疫熒光染色,顯微照相后利用Image J software(National Institutes of Health,USA)觀察內(nèi)膜增生和中膜變化確定其血管增生狀態(tài);利用熒光顯微鏡觀察Esdn~(-/-)小鼠和野生型小鼠;平滑肌細(xì)胞特異性敲除小鼠Cre~(+/-)Esdn~(flox/flox)小鼠及其對照Cre~(-/-)Esdn~(flox/flox)小鼠各組不同時(shí)間點(diǎn)血管組織中ESDN、CD31(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白)和SMa-actin(VSMC標(biāo)志蛋白)的陽性熒光強(qiáng)度。4.VSMC培養(yǎng)與siRNA敲低ESDN的表達(dá)按照本室報(bào)道的貼塊法培養(yǎng)大鼠VSMC,取3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將VSMC接種在60mm小皿中,用含20%胎牛血清的無抗生素培養(yǎng)基,在37℃和5%CO_2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12-24小時(shí)后,待細(xì)胞生長至60-70%融合時(shí),細(xì)胞用20 nM的ESDN siRNA或通用陰性對照(銳博)小干擾RNA轉(zhuǎn)染,按照Lipofectamine RNAi Max試劑盒操作說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后根據(jù)細(xì)胞密度換液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,換成無血清培養(yǎng)基血清饑餓24 h后,分別給予PDGF-BB(10 ng/mL)刺激不同時(shí)間(0、5、15、30 min),收集RNA確定轉(zhuǎn)染效率和蛋白用于Western blot檢測PDGF信號途徑的變化。5.細(xì)胞膜蛋白和胞漿蛋白的提取培養(yǎng)的VSMCs,利用siRNA敲低ESDN表達(dá),血清饑餓24 h后,應(yīng)用PDGF刺激不同時(shí)間后,利用Invent公司Minute-~(TM)總膜和質(zhì)膜提取試劑盒分別提取胞漿和胞膜蛋白,Western blot檢測PDGFR-β在敲低ESDN表達(dá)后在細(xì)胞各組分中分布的不同。6.細(xì)胞表面PDGFR-β的測定為觀察ESDN表達(dá)對VSMC表面PDGFR-β動(dòng)態(tài)變化的影響,培養(yǎng)的大鼠VSMC應(yīng)用siRNA敲低ESDN的表達(dá)后,在PDGF刺激不同時(shí)間(0、5、30 min)的培養(yǎng)基中加入生物素(0.15 mg/mL sulfo-NHS-SS-biotin,Pierce,Rockford,IL)對細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記,10 min后應(yīng)用1×PBS緩沖液(137 mM NaCl,2.7 mM KCl,2 mM KH_2PO_4,10 mM Na_2HPO_4)清洗并終止反應(yīng),加入細(xì)胞裂解液(50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl,0.5%脫氧膽酸鈉,1%NP-40,0.1%SDS,1mM EDTA),臨用前加入complete proteinase inhibitor(Roche Applied Sciences)和phosphatase inhibitor cocktails(Sigma-Aldrich),離心收集上清用于細(xì)胞總PDGFR-β的測定;應(yīng)用鏈合親霉素(Streptavidin-agarose beads,Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY)收集生物素標(biāo)記的蛋白,清洗后上樣Western blot檢測細(xì)胞表面PDGFR-β的變化。結(jié)果:1.平滑肌細(xì)胞特異性Esdn敲除小鼠基因型鑒定對Esdn~(-/-)小鼠;平滑肌細(xì)胞特異性敲除小鼠Cre~(+/-)Esdn~(flox/flox)小鼠及其對照Cre~(-/-)Esdn~(flox/flox)小鼠進(jìn)行基因型鑒定。Esdn~(-/-)小鼠基因型鑒定引物(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為360 bp):上游引物:5’-CAGCCAAACCTCCAGAAAAG-3’下游引物:5’-AAGCTTAAGTGATGTGACAG-3’Esdn~(flox/flox)小鼠基因型鑒定引物(280bp,野生型為230 bp)上游引物:5’-CAGCCAAACCTCCAGAAAAG-3’下游引物:5’-TCACAAGAGAGAGGGGTGCT-3’SM22 Cre小鼠基因型鑒定引物(陽性對照324 bp,Cre 100 bp)SM22-Cre上游引物:5’-GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3’SM22-Cre下游引物:5’-GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT-3’SM22-Cre陽性對照上游引物:5’-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3’SM22-Cre陽性對照下游引物:5’-TAGGTGGAAATTCTAGCATCATC-3’瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在目的區(qū)域呈現(xiàn)清晰的條帶,表明基因型鑒定正確,平滑肌細(xì)胞特異性Esdn基因敲除小鼠構(gòu)建成功。提取不同基因型小鼠血管組織進(jìn)行Western blot檢測ESDN的表達(dá),在Esdn~(-/-)小鼠血管組織中未檢測到ESDN的表達(dá),而在平滑肌細(xì)胞特異性基因敲除小鼠血管組織中ESDN的表達(dá)較對照小鼠顯著下降,結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了基因型鑒定正確,表明平滑肌細(xì)胞特異性基因敲除小鼠構(gòu)建成功。2.ESDN缺失促進(jìn)內(nèi)膜損傷后的血管增生WT、Esdn~(-/-)小鼠結(jié)扎不同時(shí)間后取材,HE染色結(jié)果顯示,隨著結(jié)扎時(shí)間的延長,與對照組相比,Esdn~(-/-)小鼠血管中膜VSMC排列紊亂,內(nèi)膜逐漸增厚,管腔狹窄,在結(jié)扎21 d時(shí)達(dá)到高峰。隨后Western Blot檢測平滑肌增殖標(biāo)志蛋白OPN,平滑肌分化標(biāo)志蛋白SMa-actin、SM22a的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,與對照組相比,隨著結(jié)扎時(shí)間的延長,Esdn~(-/-)小鼠血管組織中OPN的表達(dá)均逐漸增加,結(jié)扎21 d時(shí)達(dá)到高峰;SMa-actin、SM22a的表達(dá)均逐漸降低,結(jié)扎21 d時(shí)達(dá)到最低。應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)進(jìn)一步觀察ESDN表達(dá)對血管中膜SMC增生的影響,結(jié)果顯示,在結(jié)扎21 d時(shí),ESDN的表達(dá)與血管組織中SMC標(biāo)志物SMa-actin的表達(dá)呈現(xiàn)共定位現(xiàn)象,表明ESDN可能通過影響中膜SMC的增殖進(jìn)而影響血管增生過程。這一結(jié)果在平滑肌細(xì)胞特異性敲除小鼠得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。3.ESDN表達(dá)下調(diào)促進(jìn)PDGF的信號途徑為進(jìn)一步探討ESDN缺失促進(jìn)血管增生的分子機(jī)制,體外培養(yǎng)大鼠VSMC,siRNA敲低ESDN的表達(dá),血清饑餓后,用10 ng/mL的PDGF-BB處理VSMC不同時(shí)間后收集蛋白,Western blot檢測PDGF受體磷酸化及其下游信號途徑的變化。結(jié)果顯示,與對照組相比,ESDN表達(dá)下調(diào)促進(jìn)PDGF誘導(dǎo)的PDGFR-β的磷酸化活化,在PDGF刺激15 min達(dá)到峰值。同時(shí)對與VSMC遷移和增殖相關(guān)的PDGF下游信號分子進(jìn)行了檢測,Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,ESDN表達(dá)下調(diào)促進(jìn)PDGF誘導(dǎo)的MAPK-ERK和Akt的磷酸化活化,在PDGF刺激后的5 min和15 min各自達(dá)到其峰值。這一結(jié)果表明,ESDN表達(dá)下調(diào)可能通過促進(jìn)PDGF誘導(dǎo)的PDGFR-β的磷酸化活化,進(jìn)而激活下游相關(guān)信號分子MAPK-ERK和Akt的磷酸化,加速VSMC的遷移和增殖過程,與整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致。4.ESDN敲低加速PDGF誘導(dǎo)的PDGFR-β胞吞過程研究表明,PDGF與其相應(yīng)的受體PDGFR-β結(jié)合后引起受體磷酸化活化并經(jīng)過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),為確定ESDN表達(dá)是否能夠調(diào)控PDGF誘導(dǎo)的PDGFR-β胞吞過程,應(yīng)用生物素標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白并用Streptavidin富集并Western blot檢測細(xì)胞膜上PDGFR-β的分布,結(jié)果表明ESDN敲低后細(xì)胞表面的PDGFR-β較對照組顯著減少,表明ESDN表達(dá)下調(diào)促進(jìn)PDGF誘導(dǎo)的PDGFR-β胞吞過程;同時(shí)提取了膜蛋白、胞漿蛋白檢測了PDGFR-β在細(xì)胞不同組分的分布,結(jié)果表明與對照組相比,ESDN敲低顯著減少了PDGF刺激后PDGFR-β在細(xì)胞膜的分布,而在同一時(shí)間點(diǎn)PDGFR-β在細(xì)胞胞漿的分布顯著高于對照組。這些結(jié)果表明,ESDN表達(dá)下調(diào)促進(jìn)PDGF的信號途徑可能是通過增強(qiáng)PDGFR-β胞吞過程相關(guān)。結(jié)論:1.ESDN缺失小鼠和平滑肌細(xì)胞ESDN特異性敲除小鼠血管中膜平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜增生增強(qiáng);2.ESDN表達(dá)下調(diào)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞PDGF信號途徑;3.ESDN調(diào)控PDGF的信號途徑的分子機(jī)制與其對PDGFR-β胞吞過程的調(diào)控有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54
【圖文】：

圖 1 小鼠子代基因型鑒定和不同品系小鼠血管組織 ESDN 的表達(dá)Fig.1 The identification of the offspring genotypes and ESDN expressionlevels in aortaA：PCR results . 1: WT, 2: Esdn-/-mice, 3: Esdnflox/+mice, 4: Esdnflox/floxmice,5: Cre-/-Esdnflox/floxmice, 6: Cre+/-Esdnflox/floxmice. B: Western blottinganalysis of ESDN expression in aorta from different mice.

29圖 2 野生型和 Esdn-/-小鼠結(jié)扎后不同時(shí)間點(diǎn)血管增生的變化Fig.2 The vascular hyperplasia in isolated aorta from WT and Esdn-/-mice at different time point after ligationA: HE staining of representative cross-sections of the carotid artery inwild and Esdn-/-mice at different times of ligation. Bar: 200 m. B:Immunofluorescence staining of -actin in ligated carotid arteries ofdifferent ages. Bar: 50 m.

30圖 3 野生型和 Esdn-/-小鼠結(jié)扎后不同時(shí)間點(diǎn)血管組織中平滑肌細(xì)胞表型相關(guān)蛋白表達(dá)的變化Fig.3 The marker genes of phenotypic switch expression in isolated aorta fromWT and Esdn-/-mice at different time point after ligationCompared with the WT group, the expression of SM -actin and SM22was decreased, while OPN expression was increased in Esdn-/-aorta atdifferent time points after ligation. n=3, *P<0.05 compare with control groupat the same time point.

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本文編號：2798302